Гель - хроматография (эксклюзионная хроматография)

Это вид хроматографии, основанный на использовании различия в размерах молекул. Его называют также гель-фильтрацией или ситовой хроматографией. Неподвижной фазой является растворитель, находящийся в порах геля, а подвижной – сам растворитель, т.е. и подвижную, и неподвижную фазы составляет одно и то же вещество или одна и та же смесь вещества. Гели готовят на основе полиакриламида, крахмала, декстрана, агар-агара или других природных и синтетических соединений. В процессе гель-хроматографии могут быть отделены крупные молекулы, которые гелем не сорбируются, т.к. их размеры превышают размеры пор, от мелких, которые проникают в поры, а затем могут быть элюированы. Размеры пор могут быть регулированы изменением состава растворителя и набухания геля. Применяемые гели подразделяют на мягкие, полужесткие и жесткие. Мягкимиявляются высокомолекулярные органические соединения с незначительным числом поперечных связей (декстраны, крахмал)Полужесткимиявляются гели полученные путем полимеризации (стирогели – продукты сополимеризации стирола и дивинилбензола), на них осуществляется гель-проникающая хроматография. Кжестким гелям относят силикагели и часто пористые стекла, хотя они и не являются собственно гелями. Они имеют фиксированные поры и используются при высоком давлении. Практическое применение гель-хроматографии связано, в основном, с разделением смеси ВМС, например смол и асфальтенов.

Лекция 15

ГАЗО-ЖИДКОСТНАЯ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ГЖХ)

В 1941 г. американские ученые А. Мартин и Р. Синг впервые предложили метод хроматографии в жидкостно-жидкостном варианте и указали на возможность осуществления газо-жидкостной хроматографии. В 1952 г. А. Мартин и А.Джеймс создали теорию процесса и разработали конкретную методику анализа углеводородов ГЖХ. В основу было положено различие в коэффициентах распределения анализируемых веществ между 2-мя несмешивающимися жидкой неподвижной и подвижной газообразной фазами.

Неподвижной фазой является жидкость, подвижной фазой – газ-носитель.

Принципиальная схема ГЖ хроматографа (рис):

загрузка разделяемой смеси

1. баллон с газом-носителем

2. дозатор - устройство для ввода пробы в хроматографическую колонку

3. хроматографическаяколонка с жидкой неподвижной фазой

4. термостат

5. детектор

6. блок - преобразует параметры веществ в разделенной смеси в электрический сигнал, усиливает сигналы

7. регистрирующее устройство

ПАРАМЕТРЫ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕ ХРОМАТОГРАММЫ ГЖХ Регистрируемая самописцем кривая изменения сигнала детектора называется хроматограммой.

Типичная выходная кривая (хроматограмма) проявительного (элюентного) анализа приведена на рис.: [С]

А” А B C V, мл

точка «А”» соответствует вводу анализируемой пробы,

т. А – появлению на выходе несорбирующегося (слабосорбирующегося) компонента

т. В - появлению на выходе анализируемого вещества

линия А”ABC– называют нулевой линией

кривая – называется хроматографическим пиком, характеризуется высотой h, шириной и площадью.

1. Время удерживанияt_R - это время, прошедшее от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума соответствующего пика, оно складывается из 2 величин:

- пребывание в пустотах сорбента (мертвый объем V_o),

_- t ₀ -время удерживания несорбирующегося (слабосорбирующегося) вещества, например, воздуха (при этом появляется маленький пик).

Исправленое время удерживания- время, прошедшее с момента появления максимума пика несорбируемого компонента до пика соответствующего соединения:

t_R' = t_R1 - t₀;

Время удерживания зависит от Т^оС, скорости газа-носителя и размера образца.

2. Относительное время удерживанияt_отн, определяется как отношение времени удерживания неизвестного веществаt_хк времени удерживания эталонного веществаt_этал:

t _отн = t_х / t_этал

Относительное время удерживания ни от чего не зависит.

3.Умножив время удерживания на объемную скорость элюентаFили среднюю скорость газа-носителя (мл/мин), прошедшего через колонку с момента ввода пробы до момента появления максимального пика, получимудерживаемый объемV_R:

V_R = t_R ^.  F ;

Удерживаемый объем пропорционален времени удерживания.

Приведенный или исправленный объем удерживанияV_R' - это объем удерживания с поправкой на мертвый объем колонкиV₀, т. е. на объем удерживания несорбируемого (слабосорбируемого) компонента:

V_R' = V_R - V₀;

V_R' пропорционален отрезкуАА” (рис.), характеризует удерживаемый объем несорбирующегося газа, или мертвый объем колонки.

Характеристикой удерживания является также коэффициент емкости K', определяемый как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе:

K' = m_н / m_п

Величину K' легко определить по хроматограмме:K'= t_R'- t₀ / t₀

4. В ГЖХ при анализе соединений одного гомологического ряда для качественной идентификации отдельных компонентов смеси пользуются индексами удерживания – индексами КовачаI_x. В качестве стандарта выбирают нормальный алкан. Далее берутся два соседних алкана, один из которых элюируется до, а другой – после исследуемого соединения.

lg t’_x - lg t’_n

I_x = 100 ----------------------- + 100n

lg t’_(n+1) - lg t’_n

где: t’_n < t’_x < t’_(n+1) n – число атомов углерода алкана

Для качественного анализа и идентификации какого-либо неизвестного соединения снимают хроматограмму этого соединения, а также хроматограммы двух нормальных парафинов (алканов) с известным числом атомов углерода в молекуле, время удерживания одного из которых меньше, а другого больше, чем время удерживания исследуемого соединения в тех же условиях. Индексы удерживания позволяют не только идентифицировать по их значениям неизвестные вещества, но и предсказывать, каким должен быть индекс удерживания того или иного вещества на определенной фазе и при определенной температуре.

КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ

Для полной характеристики хроматографической колонки необходимо знание того, насколько избирательно действие выбранного адсорбента по отношению к компонентам разделяемой смеси, т.е. необходимо знание селективности адсорбента. Важнейшими параметрами хроматографического разделения являются его эффективность и селективность.

Существенное значение в теории хроматографического процесса имеет метод теоретических тарелок (ТТ). В этом методе(ТТ) впервые предложенном А.Мартином и Р.Сингом, хроматографическая колонка мысленно делится на ряд элементарных участков –«тарелок» и предполагается, что на каждой тарелке очень быстро устанавливается равновесие между сорбентом и подвижной фазой. Каждая новая порция газа-носителя вызывает смещение этого равновесия, вследствие чего часть вещества переносится на следующую тарелку, на которой, в свою очередь, устанавливается новое равновесное распределение и происходит перенос вещества на следующую тарелку. В результате этих процессов хроматографируемое вещество распределяется на нескольких тарелках, причем на средних тарелках его концентрация оказывается максимальной по сравнению с соседними тарелками.ТТ– условный участок колонки, на котором происходит единичный акт разделения смеси:

L L

Число ТТ N = 5,54 * (-------)² N= ------ H= L / N

w_1/2 H

Где H - высота, эквивалентная теоретической тарелке ВЭTТ

L - длина слоя сорбента, на которой произведено поглощение и размещеноN теоретических тарелок

w_1/2 - ширина пика на половине высоты

Эффективность колонки, измеряемая высотой теоретических тарелок (ВЭТТ) и обратно пропорциональная их числу (N)тем выше, чем уже пик вещества, выходящего при том же времени удерживания. Значение эффективности может быть вычислено по хроматограмме по следующей формуле:

N = 5,54 ^. (t_R / w_1/2)²

Где: t_R - время удерживания, w_1/2 - ширина пика на половине высоты

В набивных колонках N = 5-20 тыс В капиллярныхN=10⁶

При рассмотрении разделения смеси двух компонентов важным параметром служит также степень (коэффициент) разделения R_S:

R_{S =} ^{ t R}

w_1/2 (1)+ w_1/2 (2)

Где: w_1/2 - ширина 1 и 2 пиков на половине высоты Пики считаются разрешенными, если величинаR_S больше или равна 1,5.

2. Селективность разделения(коэффициент) двух веществKcможет быть выражен с помощью времен удерживания, по уравнению:

t _R2 – t _R1

Kc= 2 --------------

t _R2 + t _R1

Коэффициент селективности может быть выражен также соотношением:

Г₂ – Г₁

Kc=2 -------------- Г – коэффициент Генри

Г₂ + Г₁

Концентрация вещества в адсорбенте (неподвижной фазе), г/см³

Г = ----------------------------------------------------------------------

Концентрация вещества в газовой фазе (подвижной фазе), г/см³

Селективность адсорбента связана с различием его адсорбционной способности по отношению к компонентам анализируемой смеси. Разделительная способность хроматографической колонки определяется как ее эффективностью, так и селективностью. Достаточно полное разделение можно осуществить лишь при сочетании высокой эффективности колонки с хорошей селективностью фазы: (рис. )

высокая эффективность высокая эффективность низкая эффективность

высокая селективность низкая селективность высокая селективность

1 2 1 2 1 2

Если  t _R = w_1/2 (1)+ w_1/2 (2)₎ то R_S =1 – происходит достаточно полное разделение

R_S >=1 - можно говорить об эффективном разделении, это основное условие эффективного разделения (рис) 2

1 2 1 1+2

0,6 < R_S <1 0,4 < R_S <0,6 R_S <0,4

R_S <=1- неэффективное разделение

Графически уравнение Генри выглядит так: (рис

Сж Сж

2 1 2 1

Сг Сг

tg _ =Г_ tg _ = Г_

2 – лучше растворяется – значит неподвижная фаза удерживает сильнее вещество

1 – вещество выйдет быстрее, т.к. хуже удерживается неподвижной фазой

Для каждого соединения имеется свой коэффициент, и чем больше различие (больше угол), тем лучше разделить вещества.

Регулировать селективность колонки можно изменяя природу неподвижной фазы

5. Достоинства метода ГЖХ

6. 1. Высокая разрешающая или разделяющая способность (за 0,5-1,0 час можно получить хроматограмму разделения от 10 до 100 соединений.

7. 2. Высокая чувствительность (можно обнаружить вещества с концентрацией 10^-10%)

8. 3. Малый размер пробы, необходимой для анализа (объем 1-10 мкл, 1 мкл=10^-6л)

9. 4. Малая продолжительность процесса хроматографического разделения

10. 5. Высокая точность метода определения количества веществ (средняя относительная погрешность - 5%, а в приборах более высокого класса до 2 %.

11. 6. Простота аппаратурного оформления, доступность прибора.

Лекция 16

ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ БЛОКОВ ГЖ ХРОМАТОГРАФА

1. Блок регулировки газа-носителя – предназначен для задания и поддержания

определенной постоянной скорости газа-носителя

2. Дозатор – это устройство (узел), предназначенное для точного количественного отбора пробы и введения ее в хроматографическую колонку. Основным требованием является воспроизводимость размера пробы и постоянство условий ее введения в колонку. Внутренняя поверхность дозатора не должна обладать каталитической или адсорбционной активностью по отношению к пробе, а введение пробы не должно вызывать резкого изменения условий работы колонки и других узлов хроматографа. Газообразные и жидкие пробы вводят при помощи специальных микрошприцев. Твердые пробы вводят или после растворения их в подходящем растворителе, или непосредственным испарением пробы в нагретом дозаторе, куда она вводится с помощью игольного ушка.

3. Хроматографическая колонка. Они отличаются:

А) по материалу изготовления - сталь, латунь, медь, стекло, тефлон, кварц и др., в металлических (непрозрачных) трудно проконтролировать плотность набивки, стеклянные же хрупкие, их невозможно гнуть,

Б) по форме – U, W –образные (1,2), спиральные (объемные) (3), спиральная плоская (4):

1 2 3 4

В) по диаметру:

• набивные, d=2-5 mm, l=1-20 m (чаще l=1-3 m)

• капиллярные d= 0,2-1 mm, l=50-100 m и выше

У капиллярных стенки колонки выполняют роль твердого инертного носителя.

Эффективность разделения в капиллярных колонках существенно выше, чем в насадочных, так как существенно уменьшается сопротивление потоку газа. Объем пробы значительно меньше (в 100-1000 раз).

3. Термостат. Назначение – поддержание постоянной температуры с высокой точностью (до+-0,05-0,5 ^оС). Эта Т ^оС< ВТП жидкой фазы.

Влияние Т^oС на эффективность разделения и время удерживания.

А) если Т^oС постоянная, то получается хорошее разделение, но долгое время удерживания, процесс растягивается, протекает очень медленно, (рис. )

Т пост Т^o С (1)< Т^oС(2)

Б) Т^o С (1)< Т^oС(2), время удерживания компонентов сокращается (рис. )

В) Т^o С (2)< Т^oС(3) >>Т^o С (1) Cкорость растворения компонентов является близкой, происходит плохое разделение:

При анализе сложных смесей, включающих компоненты, выкипающие при температурах

Тк-Тн<100^oC, анализ этой смеси проводят при постоянной температуре -– изотермический режим.

Если разница в Т^oС кипения составляет  T = Тк - Тн>=100^oC, анализ проводят в режиме линейного программирования температуры.

Пример. Смесь нескольких компонентов. В смеси присутствуют компоненты с Тк=250^oС и Тн=100^oС ,  T =150^oС

- Изотермический режим, Т^oС=100^oС. При этой температуре хорошо разделяются компоненты, которые принадлежат к низкокипящей области, а высококипящие не разделяются, т.к. высококипящие при такой температуре плохо растворяются в неподвижной жидкой фазе:

- Изотермический режим, Т^oС=150 ^oС (200^o С). Низкокипящие стали растворяться одинаково, не разделились, но т.к. температура увеличилась, высококипящие разделились хорошо:

Трудно подобрать в изотермическом режиме необходимую температуру. В таком случае применяютрежим линейного программирования температуры. В хроматографе есть блок программирования температуры, можно задать Тн, Тк и скорость изменения Т^оС в град/мин. Тн=100^оС, Тк=150^оС, V=2^оС/мин, анализ проходит за 25 мин:

Тн=100^оС Тк=150^оС

5. Детектор .Находится на выходе из хроматографической колонки. Это устройство, которое преобразует свойства выходящих из колонки компонентов смеси в электрический сигнал. В настоящее время существует около 50 видов детекторов, которые делятся на деструктивные (вещество разрушается) и недеструктивные (разрушения вещества не происходит)

Требования:

1. высокая чувствительность 2) линейность отклика

3. высокая селективность 4) низкая инерционность

Основные типы детекторов.

1. Детектор по теплопроводности (катарометр).

Схема катарометра: 1 – ввод газа из колонки; 2 – изолятор; 3 – выход в атмосферу;

4 – металлический блок; 5 – спираль

С1, С2 – измерительные ячейки; R1, R2 – сравнительные ячейки

1 – ввод газа из колонки; 2 – ввод чистого газа-носителя; 3 – источник тока;

4 – регулятор тока, проходящего через нити; 5 – миллиамперметр; 6 – установка нуля

Принцип работы катарометра основан на изменении электрического сопротивления проводника в зависимости от теплопроводности окружающей среды (элюата: подвижная фаза + вещество). Катарометр преобразует зависимость теплопроводности среды от концентрации вещества в хроматографической смеси в электрический аналитический сигнал. Схема катарометра – мостовая, схема моста Уитсона. Сопротивления (два или четыре), расположенные в соответствующих камерах (ячейках), являются активными плечами измерительного моста, на который подается постоянное напряжение (6-12 вольт). Активными плечами (элементами) измерительного моста могут служить платиновые, вольфрамовые или никелевые нити диаметром 5 мкм, согнутые в спирали, а также полупроводниковые сопротивления – термисторы. Электрическая схема катарометра представляет собой электрический мостик, в одно плечо которого вставлена металлическая проволочка, находящаяся в токе газа-носителя, а в другое плечо вставлена точно такая же проволочка, омываемая газом-носителем с определяемыми веществами хроматографической смеси. Через рабочую камеру проходит элюат (газ-носитель с элюируемым веществом), через другую (сравнительную) - чистый газ-носитель. Наиболее часто в качестве газов-носителей используются гелий и водород, теплопроводность которых в 6-10 раз выше, чем у большинства органических веществ. До хроматографирования оба плеча катарометра омываются инертным газом и обе проволочки имеют одинаковое электрическое сопротивление, постоянство которого выписывается регистратором (самопишущем потенциометром) в виде нулевой линии хроматограммы. Сопротивление проводника меняется в зависимости от теплопроводности газа и входящих в его состав компонентов, при прохождении газа с веществом, вещество забирает от спирали тепло, что приводит к изменению сопротивления, на выходе у моста появляется сигнал. Чем больше концентрация вещества в газе, тем больше сигнал. При поступлении в катарометр зоны вещества изменяется теплопроводность среды в плече катарометра, соответственно изменяется теплопроводность среды и электрическое сопротивление проволочки. Причём сопротивление меняется точно так же, как распределено вещество в хроматографической зоне, т.е. по закону Гаусса, графическим изображением которого является симметричная колоколообразная кривая (пик). Зависимость R = f(c) преобразуется электрической схемой катарометра в электрический аналитический сигнал, который выводится на регистратор, выписывающий зависимость в виде пика хроматограммы. В качестве регистратора используют самопишущий потенциометр или более современное устройствохранения и математической обработки информации - персональный компьютер.

Достоинство – недеструктивен, универсальный, можно анализировать многие классы органических соединений. Недостатком является низкая чувствительность -0,01%.

2. Детектор плотности (ДП). Если плотности потоков (элюата и чистого газа-носителя) различны, то нарушается равновесие в электрической схеме и возникает электрический сигнал, пропорциональный разности плотностей потоков. Недеструктивный метод.

3. Термохимический детектор (ТД). Принцип основан на измерении теплового эффекта каталитического сжигания элюата (газ-носитель – воздух, кислород) на поверхности платиновой нити. Деструктивен. Недостаток - может анализировать только горючие вещества (УВ).

4. Ионизационные детекторы. А) Пламенно-ионизационный детектор (ПИД)

Схема ПИД: 1 – ввод газа из колонки; 2 – ввод водорода; 3 – вывод в атмосферу;

4 – электрод; 5 – катод; 6 – ввод воздуха

Газы в обычных условиях не проводят ток. Под действием пламени или радиоактивного излучения в газе образуются радикалы, ионы или свободные электроны, у газа появляется электропроводность. Принцип действия ПИД основан на том, что элюат смешивают с водородом, сжигают при Т =+2000^оС. Горение происходит между двумя электродами, которые находятся под напряжением 90-300 В. К соплу горелки подается очищенный воздух. Под действием напряжения упорядочивается движение ионов, возникает ионный ток, который поступает на регистрирующее устройство. ПИД состоит из водородной горелки, расположенной между двумя электродами. При сгорании компонентов в пламени горелки происходит их ионизация, а в электрической схеме ПИД возникает ток ионизации, пропорциональный концентрации компонентов в смеси. Зависимость тока ионизации от концентрации выводится на регистратор. В современных хроматографах аналоговый сигнал с детектора поступает на аналогово-цифровой преобразователь, информация с которого обрабатывается персональным компьютером.

Чувствительность ПИД на 3-5 порядков выше, чем по сравнению с катарометром, она в значительной степени определяется соотношением количеств водорода и воздуха, а также расстоянием между электродами.

Б) Масс-спектральный детектор (МСД). Сочленение хроматографа и масс-спектрометра. Очень высокая чувствительность. В масс-спектрометре под действием электронного удара происходит ионизация, прибор записывает масс-спектр разделяемых веществ. Затем необходимо проводить анализ по осколочным ионам, сравнивать с базой данных. Чувствительность – 10^-25 г/см³

Все вышеизложенные виды детекторов не являются селективными.

Существуют селективные детекторы. При одинаковом количественном содержании в смеси соединений разных классов, они фильтруют не все соединения, а лишь те, к которым они селективны. Известны детекторы, селективные к галогенам, сере, азоту, фосфору и т.п. Удовлетворительной считается такая селективность детектора, при одинаковом соотношении 2-х веществ они достигают разделения на хроматограмме 1:10.

Электронно-захватный детектор. Принцип действия как у пламенно-ионизационного детектора, но основан на захвате электронов. В качестве газа-носителя используют азот или водород. Под действием радиоактивного излучения на молекулы азота или сжигания при очень высокой температуре щелочного металла образуются положительные ионы и медленные электроны. Под влиянием приложенного напряжения электроны быстро перемещаются к аноду, вследствие чего там возникает ток. При попадании в камеру детектора веществ, содержащих анионы, последние взаимодействуют с положительными ионами, вследствие чего происходит пропорциональное уменьшение ионизационного тока.

Лекция 17