Добавил:

Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Омский государственный медицинский университет

Предмет:

Фармакология

Файл:

Государственная фармакопея Союза Советских Социалистических Республик.doc

Скачиваний:

Добавлен:

20.03.2016

Размер:

1.94 Mб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 / 2012 13 14 15 16 17 18 19 20 > Следующая >>>

II.5. Определение активности антибиотиков методом

ДИФФУЗИИ В АГАР НА ЧАШКАХ ПЕТРИ

Описанная в предыдущем параграфе методика определения активности антибиотиков по схеме латинского квадрата предполагает использование лотков. Возможен и другой способ определения этой активности - по диффузии в агар на чашках Петри. Ниже описан трехдозный вариант этого метода <*>.

--------------------------------

<*> Этот раздел основан на разработке Всесоюзного НИИ антибиотиков и Государственного НИИ по стандартизации и контролю лекарственных средств Министерства здравоохранения СССР.

Стандартный (S) и испытуемый (U) образцы растворяют из расчета

1 мг в 1 мл (основной раствор), затем готовят по три концентрации

S S S

рабочих растворов стандарта (D1, D2, D3) и испытуемого образца

U U U

(D1, D2, D3), относящиеся друг к другу как 1:2:4. Все 6

растворов закапывают на одну чашку Петри, причем

последовательность внесения растворов в цилиндры или в лунки

должна быть случайной (возможные последовательности внесения

растворов приведены в табл. II.5.1). Число чашек n должно быть не

меньше 6.

Для уменьшения влияния колебаний во времени между внесением

различных растворов рекомендуется после внесения растворов

выдерживать чашки в течение 1-2 ч при комнатной температуре. После

S U

измерения зон угнетения роста результаты опыта у , и у

i,j i,j

(i = 1, 2, 3 - номера доз, j = 1, 2, ..., n - номера чашек)

записывают в таблицу (как показано в приведенном ниже численном

примере). Там же записывают получаемые расчетом следующие

вспомогательные величины:

S U

Si = SUM у и Ui = SUM у (II.5.1)

j i,j j i,j

- суммы по чашкам для каждой дозы стандарта и испытуемого образца;

S U

Tj = SUM у + SUM у , (II.5.2)

i i,j i i,j

- суммы по всем дозам для каждой чашки;

у = SUM у = (S1 + S2 + S3) +(U1 + U2 + U3) = SUM Tj (II.5.3)

i,j i,j j

- суммы всех диаметров зон задержки роста по всем дозам и чашкам.

Далее вычисляют:

S = S1 + S2 + S3 и U = U1 + U2 + U3 (II.5.4)

- суммы всех диаметров зон задержки роста отдельно для стандарта и

для испытуемого образца;

L = S3 - S1 и L = U3 - U1 (II.5.5)

S U

- "линейные контрасты" для стандарта и для испытуемого образца;

Q = S1 - 2S2 + S3 и Q = U1 - 2U2 + U3 (II.5.6)

S U

"квадратичные контрасты" для стандарта и для испытуемого образца.

Для проверки законности дальнейших расчетов следует провести дисперсионный анализ результатов опыта в соответствии с табл. II.5.2, а именно должно получиться F < F(95%; f, fост) для строк 2, 3, 4 и F > F (95%) для строки 1.

Выполнение первого условия одновременно означает, что вариации в этих строках 2, 3, 4 должны рассматриваться как случайные, и поэтому их следует включить в остаточную вариацию, произведя также перерасчет значимости линейной регрессии (кстати, это относится и к вариациям в строках 5 и 6, если они окажутся незначимыми). Разумеется, при указанном перерасчете степени свободы вариаций, включаемых в остаточную вариацию, должны прибавляться к числу степеней свободы последней (fост).

Таблица II.5.1

Расположение растворов стандарта и испытуемого образца

при трехдозном варианте метода диффузии в агар

┌─────┬──────────────────────────┬─────┬──────────────────────────┐

│Номер│Порядок внесения растворов│Номер│Порядок внесения растворов│

│чашек│ в цилиндры │чашек│ в цилиндры │

│ ├───┬───┬───┬────┬────┬────┼─────┼────┬────┬───┬───┬───┬────┤

│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │

├─────┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼─────┼────┼────┼───┼───┼───┼────┤

│ │ S │ S │ U │ S │ U │ U │ │ S │ U │ U │ S │ S│ U │

│1 │D1 │D2 │D2 │D3 │D1 │D2 │ 17 │ D1 │D2 │D3 │D1 │ D3│ D2 │

│ │ S │ S │ U │ S │ U │ U │ │ S │ U │ S │ S │ U│ U │

│2 │D1 │D2 │D1 │D3 │D3 │D2 │ 18 │ D1 │D2 │D3 │D2 │ D3│ D1 │

│ │ S │ S │ U │ U │ S │ U │ │ S │ U │ S │ S │ U│ U │

│3 │D1 │D2 │D3 │D2 │D3 │D1 │ 19 │ D1 │D2 │D3 │D2 │ D1│ D3 │

│ │ S │ S │ U │ U │ S │ U │ │ S │ U │ U │ S │ U│ S │

│4 │D1 │D2 │D1 │D3 │D3 │D2 │ 20 │ D1 │D2 │D3 │D3 │ D1│ D2 │

│ │ S │ S │ U │ U │ S │ U │ │ S │ U │ U │ S │ U│ S │

│5 │D1 │D2 │D1 │D2 │D3 │D3 │ 21 │ D1 │D2 │D1 │D3 │ D3│ D2 │

│ │ S │ S │ U │ U │ S │ U │ │ S │ U │ U │ S │ U│ S │

│6 │D1 │D2 │D3 │D1 │D2 │D3 │ 22 │ D1 │D2 │D3 │D2 │ D1│ D3 │

│ │ S │ S │ U │ S │ U │ U │ │ S │ U │ U │ S │ U│ S │

│7 │D1 │D3 │D1 │D2 │D3 │D2 │ 23 │ D1 │D2 │D1 │D2 │ D3│ D3 │

│ │ S │ S │ U │ S │ U │ U │ │ S │ U │ S │ U │ U│ S │

│8 │D1 │D3 │D3 │D2 │D1 │D2 │ 24 │ D1 │D2 │D3 │D3 │ D1│ D2 │

│ │ S │ S │ U │ U │ S │ U │ │ S │ U │ S │ U │ U│ S │

│9 │D1 │D3 │D2 │D3 │D2 │D1 │ 25 │ D1 │D2 │D3 │D1 │ D3│ D2 │

│ │ S │ U │ U │ U │ S │ U │ │ S │ U │ U │ S │ S│ U │

│10 │D1 │D3 │D2 │D1 │D2 │D3 │ 26 │ D1 │D3 │D1 │D2 │ D3│ D2 │

│ │ S │ U │ U │ S │ S │ U │ │ S │ U │ S │ S │ U│ U │

│11 │D1 │D1 │D2 │D3 │D2 │D3 │ 27 │ D1 │D3 │D2 │D3 │ D2│ D1 │

│ │ S │ U │ U │ S │ S │ U │ │ S │ U │ S │ S │ U│ U │

│12 │D1 │D1 │D3 │D2 │D3 │D3 │ 28 │ D1 │D3 │D3 │D2 │ D1│ D2 │

│ │ S │ U │ S │ S │ U │ U │ │ S │ U │ U │ S │ U│ S │

│13 │D1 │D1 │D2 │D3 │D2 │D3 │ 29 │ D1 │D3 │D1 │D3 │ D2│ D2 │

│ │ S │ U │ S │ U │ U │ S │ │ S │ U │ S │ U │ U│ S │

│14 │D1 │D1 │D3 │D2 │D3 │D2 │ 30 │ D1 │D3 │D3 │D2 │ D1│ D2 │

│ │ S │ U │ S │ U │ U │ S │ │ S │ U │ S │ U │ U│ S │

│15 │D1 │D1 │D2 │D3 │D2 │D3 │ 31 │ D2 │D3 │D2 │D1 │ D2│ D3 │

│ │ S │ U │ U │ S │ S │ U │ │ S │ U │ U │ S │ S│ U │

│16 │D1 │D2 │D3 │D2 │D3 │D1 │ 32 │ D1 │D3 │D1 │D2 │ D3│ D2 │

└─────┴───┴───┴───┴────┴────┴────┴─────┴────┴────┴───┴───┴───┴────┘

Если дисперсионный анализ дал нужный результат (т.е. выполняются указанные выше условия), то вычисляется логарифм отношения активностей испытуемого образца и стандарта по формуле:

U 4 U - S

M = lg ---- = --- I ---------, (II.5.7)

A 3 L + L

S U S

где A и A - активности, соответствующие рабочим растворам, а I -

U S

логарифм знаменателя прогрессии разведения (в данном случае I =

lg 2 = 0,301). Тогда отношение активностей равно:

R = antilg M (II.5.8)

Чтобы найти отношение активностей основных растворов

а /а , надо умножить величину R на коэффициент, учитывающий

U S

соответствующие (например, максимальные) степени разведения

основных растворов стандарта и образца ("гамма " и "гамма ").

S U

Тогда имеем:

"гамма "

а = а R --------. (II.5.9)

U S "гамма "

Границы 95%-ного доверительного интервала для логарифма

отношения активностей вычисляются по формуле:

--------------------

/ 2 8 2

M = CM +/- \/(С - 1)(CM + --- I ), (II.5.10)

H, B 3

где

2 2

C = L / (L - t Sост ), (II.5.11)

причем L и Sост берутся из табл. II.5.2, а t - есть значение

критерия Стьюдента для Р = 95% и fост числа степеней свободы

величины Sост. Границы доверительного интервала для отношения

активностей (R и R ) будут антилогарифмами величин М и M, а для

H B H B

доверительных границ активности образца надо вводить коэффициент

"гамма " / "гамма " в соответствии с формулой II.5.9.

U S

Пример. II.8. Активность стандарта - 950 ЕД/мг. Основной

раствор стандарта готовят из расчета 1 мг/мл, так что a = 950

ЕД/мл. Учитывая, что контрольная концентрация для данного

антибиотика равна 1 ЕД/мл, готовят рабочие растворы стандарта D1,

S S

D2 и D3 путем разведения основного раствора в 500, 1000 и 2000

раз. Полагая, что активность испытуемого образца близка к

активности стандарта, и учитывая, что рабочие концентрации для

U U U

образца D1, D2, D3, должны быть близки к рабочим концентрациям

S S S

стандарта D1, D2, D3, основной раствор образца разводят также в

500, 1000 и 2000 раз. Количество чашек n = 6.

Результаты опыта записаны в табл. II.5.3. Там же записаны

значения Si, Ui, Tj и у, вычисленные по формулам II.5.1 - II.5.3.

По этим значениям, пользуясь формулами II.5.4 - II.5.6, получаем:

S = 3310; L = 325; Q = - 5;

S S

U = 3325: L = 345; Q = -5.

U U

Дисперсионный анализ результатов опыта представлен

в табл.II.5.4, из которой видно, что условия незначимости вариаций

в строках 2, 3 и 4 и значимости вариации в строке 1 выполняются,

что позволяет перейти к дальнейшим расчетам.

Прежде всего следует пересчитать остаточную вариацию с

включением в нее незначимых вариаций. Поскольку в данном случае

вариации незначимы не только в строках 2, 3 и 4, но и в строке 5,

последнюю тоже следует включить в остаточную вариацию. Тогда

получаем новое значение SUMост = 200,70 + 16,66 + 1,39 + 0 + 6,25

+ 225,00 при числе степеней свободы fост = 25 + 4 = 29, так что

Sост = 225,00/29 = 7,759. Новые результаты дисперсионного анализа

представлены в табл. II.5.5.

Таблица II.5.2

Дисперсионный анализ результатов опыта

┌─────┬──────────────────────┬────────┬───────────────────────┬────────────┬────────────┬─────────────┐

│Номер│ │ Число │ │ Дисперсия │ Отношение │ Табличные │

│стро-│ Источник вариаций │степеней│ Сумма квадратов SUM │ 2 SUM │ дисперсий │ значения │

│ки │ │свободы │ │ s = --- │ 2 2 │F(95%,f,fост)│

│ │ │ │ │ f │F = s / Sост│ │

├─────┼──────────────────────┼────────┼───────────────────────┼────────────┼────────────┼─────────────┤

│ 1 │Линейная регрессия │ 1 │ 2 │ 2│Отношение │Значения │

│ │ │ │(L + L ) / 4n - L │Дисперсии s │дисперсий F│F(95%,f,fост)│

│ │ │ │ S U │получаются │получается │берутся из │

│ 2 │Непараллельность │ 1 │ 2 2 │делением │делением │таблицы, │

│ │тарируемых прямых │ │(L + L ) / 2n - L │сумм квадра-│дисперсий из│имеющейся в │

│ │ │ │ S U │тов SUM на│предыдущего │руководствах │

│ 3 │Квадратичная регрессия│ 1 │ 2 │соответству-│столбца на│по математи- │

│ │ │ │(Q + Q ) / 12n = Q │ющие им чис-│ 2 │ческой ста- │

│ │ │ │ S U │ла степеней│Sост, т.е.│тистике и │

│ 4 │Различие квадратичных │ 1 │ 2 2 │свободы │на остаточ-│биометрии, а │

│ │регрессий │ │(Q + Q ) / 6n - Q │ │ную диспер-│также в │

│ │ │ │ S U │ │сию │сборниках │

│ 5 │Между приготовлениями │ 1 │ 2 2 2 │ │ │математико - │

│ │ │ │(S + U ) / 3n - у / 6n│ │ │статистичес- │

│ │ │ │ 2 2 │ │ │ких таблиц │

│ 6 │Между чашками │ n - 1 │SUM T / 6 - у / 6n │ │ │ │

│ │ │ │ j │ │ │ │

│ 7 │Остаточная │fост = │Остаточная сумма ква- │ │ - │ │

│ │ │5(n - 1)│дратов SUMост получа- │ │ │ │

│ │ │ │ется вычитанием сумм │ │ │ │

│ │ │ │квадратов всех преды- │ │ │ │

│ │ │ │дущих строк из пол- │ │ │ │

│ │ │ │ной суммы квадратов │ │ │ │

│ 8 │Полная │6 n - 1 │ 2 2 │ - │ - │ - │

│ │ │ │SUM у - у / 6n │ │ │ │

│ │ │ │i,j i,j │ │ │ │

└─────┴──────────────────────┴────────┴───────────────────────┴────────────┴────────────┴─────────────┘

Таблица II.5.3

┌──────┬───────────────────────────┬────────────────────────────┬─────────┐

│ │ Стандарт │ Образец │ │

│Номера├────────┬─────────┬────────┼────────┬─────────┬─────────┤ Суммы │

│чашек │ S │ S │ S │ U │ U │ U │по каждой│

│ │ D1 │ D2 │ D3 │ D1 │ D2 │ D3 │ чашке │

├──────┼────────┼─────────┼────────┼────────┼─────────┼─────────┼─────────┤

│ 1 │ 155 │ 185 │ 210 │ 155 │ 185 │ 210 │T1 = 1100│

│ 2 │ 155 │ 180 │ 210 │ 155 │ 185 │ 220 │Т2 = 1105│

│ 3 │ 165 │ 190 │ 215 │ 160 │ 190 │ 215 │Т3 = 1135│

│ 4 │ 155 │ 185 │ 210 │ 155 │ 185 │ 210 │Т4 = 1100│

│ 5 │ 150 │ 180 │ 210 │ 155 │ 180 │ 205 │Т5 = 1080│

│ 6 │ 160 │ 185 │ 210 │ 155 │ 185 │ 220 │Т6 = 1115│

│ │S1 = 940│S2 = 1105│S3= 1265│U1 = 935│U2 = 1110│U3 = 1280│у = 6635│

└──────┴────────┴─────────┴────────┴────────┴─────────┴─────────┴─────────┘

Таблица II.5.4

┌──────┬─────────────┬──┬────────┬────────┬───────┬──────────────┐

│ │ │ │ │ 2 │ │ │

│Номер │ Источник │f │ SUM │ s │ F │F (95%; f, 25)│

│строки│ вариаций │ │ │ │ │ │

├──────┼─────────────┼──┼────────┼────────┼───────┼──────────────┤

│1 │Линейная │1 │18704,17│18704,17│2329,87│ 4,24 │

│ │регрессия │ │ │ │ │ │

│2 │Непараллель- │1 │16,66 │16,66 │ 2,08│ 4,24 │

│ │ность прямых │ │ │ │ │ │

│3 │Квадратичная │1 │1,39 │ 1,39 │ 0,17│ 4,24 │

│ │регрессия │ │ │ │ │ │

│4 │Различие │1 │0 │ 0 │ 0 │ 4,24 │

│ │квадратичес- │ │ │ │ │ │

│ │ких регрессий│ │ │ │ │ │

│5 │Между приго-│1 │6,25 │ 6,25 │ 0,78│ 4,24 │

│ │товлениями │ │ │ │ │ │

│6 │Между чашками│5 │278,47 │55,69 │ 6,94│ 2,60 │

│7 │Остаточная │25│200,70 │ 8,028 │ - │ │

│8 │Полная │35│19207,64│ - │ - │ │

└──────┴─────────────┴──┴────────┴────────┴───────┴──────────────┘

Таблица II.5.5

┌──────────────────┬──┬────────┬────────┬───────┬────────────────┐

│ │ │ │ 2 │ │ │

│Источник вариаций │f │ SUM │ S │ F │F (0,95%; f, 29)│

├──────────────────┼──┼────────┼────────┼───────┼────────────────┤

│Линейная регрессия│1 │18704,17│18704,17│2410,77│ 4,18 │

│Между чашками │5 │ 278,47│ 55,69│ 7,18│ 2,55 │

│Остаточная │29│ 225,00│ 7,759│ - │ - │

│Полная │35│19207,64│ - │ - │ - │

└──────────────────┴──┴────────┴────────┴───────┴────────────────┘

Теперь по формулам II.5.7 - II.5.11 вычисляем:

4 3325 - 3310

M = --- 0,301 ----------- = 0,008985, R = 1,021;

3 345 + 325

2000

а = 950 х 1,021 х ----- = 970 (ЕД/мл);

U 2000

С = 18704,17 / (18704,17 - 2,045 х 7,759) = 1,0012

(t(95%,29) = 2,045),

M = 0,0090 +/- 0,0170 [- 0,0080; 0,0260];

H, B

R = [0,9817; 1,062];

Н, В

нижн 2000

а = 950 х 0,9817 х ---- = 933 (ЕД/мл);

U 2000

верх 2000

а = 950 х 1,062 х ---- = 1009 (ЕД/мл).

U 2000

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 / 2012 13 14 15 16 17 18 19 20 > Следующая >>>