II.3. Определение эквивалентных доз

Одной из основных задач биологического испытания является

0

установление эквивалентной дозы, т.е. той дозы D стандартного

препарата, которой соответствует по своей биологической активности

доза D испытуемого препарата.

Биологическая активность последнего может очень сильно зависеть от особенностей выбранной группы тест - объектов, их физиологического состояния, времени года, деталей лабораторной методики и многих других факторов. Поэтому определение эквивалентных доз требует одновременного применения испытуемого и стандартного препаратов к двум подгруппам однородной группы тест - объектов.

Определение эквивалентных доз требует также знания того, как биологическая активность зависит от дозы. Описанные ниже методы относятся к тому наиболее частому случаю, когда биологическая активность у связана линейно с логарифмом дозы D по уравнению II.2.1; проверка такой линейности производится при помощи критерия II.2.2.

Испытуемый препарат может отличаться от стандартного как по наклону прямой (т.е. по значению коэффициента Ь), так и по ее положению (т.е. по значению постоянной у0).

Если имеются основания предполагать, что наклоны обеих прямых одинаковы (Ь = Ь0) и, следовательно, различие между препаратами обусловлено лишь различными значениями параметра у0, то для установления эквивалентных доз достаточно определить активность одного из препаратов при двух различных дозах, а другого - при одной дозе. Разумеется, активность для каждой дозы должна определяться из нескольких измерений, так что речь идет здесь о средних активностях. Во всех случаях предполагается, что для каждой дозы использовано одно и то же число n тест - объектов и что все распределения случайных вариаций нормальны с дисперсией, не зависящей от самих активностей.

Если нет достаточных оснований предполагать, что Ь = Ь0, то

следует произвести для каждого препарата испытания по крайней мере

0 0

при двух дозах: D1, D2 и D1, D2; удобнее выбрать эти дозы так,

0 0

чтобы D2 / D1 = D2 / D1. Вообще же результаты испытания получаются

тем точнее, чем больше доз использовано. Поэтому, помимо

упомянутых выше испытаний, т. е. испытаний типов 1; 2 (или 2; 1) и

2; 2, в фармакопее предусматриваются также испытания других типов

(см. табл. IV, приложения).

По результатам испытаний вычисляют прежде всего средние эффекты при каждой из доз - отдельно для стандартного и испытуемого препаратов. Затем находят значения.

_

"ФИ" = SUM "е "у / "z ", (II.3.1)

ФИ ФИ

где "ФИ" - общее обозначение для функций Е, F, G, Н (см. табл. IV,

_

приложения), а через у обозначена вся совокупность средних

_0 _0 _0 _0 _ _ _

значений у1, у2, у3, у4, у1, у2, у3, у4; множители "е ", и

ФИ

знаменатели "z " берутся из табл. IV приложения. Полученные

ФИ

величины характеризуют: Е - различие между эффектами вследствие

различия доз; F - различие между эффектами вследствие различия

между препаратами; G - параллельность дозовых зависимостей

испытуемого и стандартного препарата; Н - линейность этих дозовых

зависимостей. Для испытаний типов 2; 1,3; 1, 3; 2 и 4; 3 надо

0 _

переставить местами коэффициенты "е " для у и у, причем для F и

ФИ

G с изменением всех знаков на обратные, а для Е и Н - без

изменения знаков; значения "z " и дисперсий остаются без

ФИ _0

изменения. Значения Н должны вычисляться отдельно для набора у и

_

отдельно для набора у, т.е. линейность дозовой зависимости

проверяется отдельно для стандартного и отдельно для испытуемого

препаратов.

По результатам испытания вычисляется также величина:

┌ n _ 2 ┐

SUM │ SUM (у - у ) │

i └ j=1 ij i ┘

V = -----------------------, (II.3.2)

0

(r + r)n(n - 1)

_

где у - индивидуальные эффекты при i-й дозе, у , - средний

ij 0 i

эффект при этой дозе; r , r - соответственно число доз для

стандартного и испытуемого препаратов; n - число испытаний при

каждой дозе (оно должно быть одинаковым при всех дозах; нарушения

этого исправляются так, как было описано в параграфе II.1). После

этого по формулам в последнем столбце табл. IV приложения

вычисляют величины А, В, V и V , необходимые для построения

G H

доверительных интервалов и проверки значимостей [при этом

используется табличное значение t для числа степеней свободы f =

0 Р

(r + r)(n - 1); I - разность логарифмов соседних доз].

Прежде всего проверяют (где это допускается числом

использованных доз) линейность дозовых зависимостей и их

параллельность, вычисляя

H

t = --------; (II.3.3)

----

/ V

\/ H

G

t = ---------. (II.3.4)

----

/ V

\/ G

Полученные значения должны быть меньше t(95%, Р).

Если нарушения линейности и параллельности дозовых

зависимостей не обнаружено, то вычисляют:

b = E / I (II.3.5)

- наклон прямой дозовой зависимости (средний для обоих

препаратов);

M = F / b (II.3.6)

- логарифм отношения эквивалентных доз, т. е. величину

0

М = lg (D / D);

0

D / D = antilg (2 + M) (II.3.7)

- отношение эквивалентных доз (в процентах);

t ---------------

M P / 2

M = ----- +/- ---------- / A(1 - g) + BM (II.3.8)

H;B 1 - g b(1 - g) \/

- Р-процентные доверительные границы для М, причем

2 2

g = Bt / b ; (II.3.9)

P

наконец, получают

0

(D / D) (II.3.10)

H; B

- Р-процентные доверительные границы для отношения эквивалентных

доз (в процентах).

Середины доверительных интервалов II.3.8 не совпадают со

значениями М из II.3.6, особенно при больших значениях g. Величина

g должна быть всегда меньше единицы, в противном случае весь опыт

следует считать некорректным и нуждающимся в повторении.

Если можно предположить, что активности испытуемого и

стандартного препаратов отличаются незначительно, следует выбирать

1 0 0

дозы так, чтобы было соответственно lg D = --- (lg D1 + lg D2),

2

0 1

lg D = --- (lg D1 + lg D2) в испытаниях типа 2; 1 и 1; 2 либо

2

0 0

D1 = D1; D2 = D2 в испытании типа 2; 2 и т. д. При существенном

отличии этих активностей такой выбор доз неоптимален и от него

следует отказаться. В этом случае из значения М, полученного по

1 0 0

формуле II.3.6, следует вычесть величины lg D - - (lg D1 + lg D2),

2

0 1 0

lg D - --- (lg D1 + lg D2), lg D1 - lg D1 или др. в зависимости

2

от типа испытания. В формулы II.3.7 и II.3.8 должно войти уже

скорректированное значение М.

Пример II.4. В табл. II.3.1 приведены результаты испытания по

стандартизации образца АКТГ; эффект характеризуется концентрацией

(в мг%) аскорбиновой кислоты в надпочечнике. В данном случае мы

имеем испытание типа 2; 3. По формуле II.3.1 получаем, используя

_

значения "e " и "z " из табл. IV приложения, а значения у - из

ФИ ФИ

табл. II.3.1:

_0 0 _ _ _

Е = [(-1)у1 + 1у2 + (-2)у1 + 0у2 + 2у3] / 5 =

= (-351 + 269 - 2 х 336 + 2 х 189) / 5 = -75,2;

F = (- 3 х 351 - 3 х 269 + 2 х 336 +

+ 2 х 256 + 2 х 189) / 6 = - 49,67;

G = (2 х 351 - 2 х 269 - 336 + 189) / 2 = 8,5:

Н = 336 - 2 х 256 + 189 = 13,0.

Далее по данным из табл. II.3.1 находим:

2552 + 1660 + 1958 + 2802 + 1582

V = --------------------------------- = 70,36,

(2 + 3) х 6 x (6 - 1)

так что формулы последнего столбца табл. IV, приложения, дают

значения:

А = 5 х 70,36/6 = 58,63; B = 77,66; V = 175,90; V = 422,16.

G H

При вычислении B учтено, что I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602.

Проверка на линейность дозовой зависимости и на параллельность

прямых дает:

--- -------

H / /V = 13,0 / \/ 422,16 = 0,633;

\/ Н

--- -------

G / /V = 8,5 / \/ 175,90 = 0,641.

\/ G

Таблица II.3.1

Уровни факторов (дозы)

┌────────────────┬───────────┬───────────┬───────────┬───────────┬───────────┐

│ │ 0 │ 0 │ │ │ │

│ Эффекты │ 0 y1, │ 0 y2, │ y1, │ y2, │ y3, │

│ │D1 = 0,1 ЕД│D2 = 0,4 ЕД│D1 = 0,1 ЕД│D2 = 0,4 ЕД│D3 = 1,6 ЕД│

├────────────────┼───────────┼───────────┼───────────┼───────────┼───────────┤

│ │ 370 │ 225 │ 310 │ 276 │ 187 │

│ │ 342 │ 268 │ 356 │ 228 │ 215 │

│ │ 335 │ 284 │ 345 │ 252 │ 200 │

│ y │ 369 │ 247 │ 313 │ 273 │ 168 │

│ ji │ 318 │ 296 │ 340 │ 279 │ 193 │

│ _ │ 372 │ 264 │ 352 │ 228 │ 171 │

│ y │ 351 │ 269 │ 336 │ 256 │ 189 │

│ i │ │ │ │ │ │

│ n _ 2│ │ │ │ │ │

│ SUM (y - y) │ 2552 │ 1660 │ 1958 │ 2802 │ 1582 │

│ j=1 ij │ │ │ │ │ │

└────────────────┴───────────┴───────────┴───────────┴───────────┴───────────┘

0

Обе эти величины меньше, чем t(95%; f) = 2,060 [для f = (r + r) х

(n - 1) = 25 степеней свободы], так что можно продолжать расчет.

По формулам II.3.5 и II.3.6 получаем:

Ь = - 75,2 / 0,602 = -124,9;

M' = - 49,67 / (-124,9) = 0,3977.

Поскольку в данном испытании средние дозы стандартного и

испытуемого препаратов не совпадают, то надо из M' вычесть

величину

lg 0,l + lg 0,4 + lg l,6 lg 0,1 + lg 0,4

------------------------ - --------------- =

3 2

= - 0,3980 + 0,6990 = 0,3010,

так что

0

М = 0,3977 - 0,3010 = 0,0967; D /D = 124,9%.

Далее вычисляем по формулам II.3.9 и II.3.8:

2

77,66 х 1,960

g = ------------- = 0,0191; 1 - g = 0,9809;

2

(- 124,9)

0,0967 1,96

M = ------- +/- ------------------ x

H,B 0,9809 (- 124,9) х 0,9809

--------------------------------

x \/ 58,63 х 0,9809 + 77,66 х 0,0961 = [- 0,0235; 0,2207].

Окончательно получаем:

0

(D /D) = [94,7%; 166,2%].

H, B

Доверительные интервалы во всех этих испытаниях могут быть

сужены, если использовать в опыте сопряженные группы животных.

Например, в испытании типа 2;2 целесообразно использовать n

четверок животных, каждая из которых содержит животных из одного

помета, одинакового пола и близкой массы тела; каждая четверка

0 0

животных используется для определения четверки значений: у1; у2,

у1 и у2. При такой постановке опыта

2 2

SUM d - SUM "ДЕЛЬТА"

V = ---------------------, (II.3.11)

3n(n - 1)

2

где d - числитель формулы II.3.2, а

2 0 0 _0 _0 _ _ 2

SUM "ДЕЛЬТА" = SUM [(у1 + у2 + у1 + у2) - (у1 + у2 + у1 + у2)] .

(II.3.12)

Число степеней свободы равно f = 3(n - 1).

Доверительный интервал может быть также сужен, если методика

испытания допускает выполнение повторных определений на каждом

животном - с достаточным разрывом во времени, обеспечивающем

восстановление исходного состояния после первого опыта. В

повторном опыте те животные, на которых определялась активность

0

у , используются для определения у и наоборот. Кроме того,

животные, получившие в первом опыте меньшую дозу, получают во

втором опыте большую дозу и наоборот (метод двойного перекреста,

см. табл. II.3.2).

Таблица II.3.2

┌────────┬────────────┬────────────┬─────────────────────────────┐

│ Группа │ Первый │ Второй │ Разность результатов │

│животных│ опыт │ опыт │ │

├────────┼────────────┼────────────┼─────────────────────────────┤

│ │ 0 │ │ 0 │

│1 │ у1 │ у2 │ ДЕЛЬТА1 = у2 - у1 │

├────────┼────────────┼────────────┼─────────────────────────────┤

│ │ 0 │ │ 0 │

│2 │ у2 │ у1 │ ДЕЛЬТА2 = у1 - у2 │

├────────┼────────────┼────────────┼─────────────────────────────┤

│ │ │ 0 │ 0 │

│3 │ у1 │ у2 │ ДЕЛЬТА3 = у2 - у1 │

├────────┼────────────┼────────────┼─────────────────────────────┤

│ │ │ 0 │ 0 │

│4 │ у2 │ у1 │ ДЕЛЬТА4 = у1 - у2 │

└────────┴────────────┴────────────┴─────────────────────────────┘

При таком построении испытания надо пользоваться формулами:

______ ______ ______ ______

E = (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА2 + ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.13)

______ ______ ______ ______

F = (ДЕЛЬТА1 + ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.14)

______ 2 ______ 2

SUM (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА1) + SUM (ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА2)

n n

V = ------------------------------------------------------ +

8n(n - 1)

(II.3.15)

______ 2 ______ 2

SUM (ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА3) + SUM (ДЕЛЬТА4 - ДЕЛЬТА4)

n n

+ -----------------------------------------------------;

8n(n - 1)

2

А = V/2, B = V/(2I ). (II.3.16)

Дальнейшие расчеты производят по формулам II.3.5 - II.3.10, причем t(P, f) берется из табл. II приложения для числа степеней свободы f = 4 (n - 1).

Пример II.5. В табл. II.3.3. приведены результаты испытания (стандартизация образца АКТГ), построенного по методу двойного перекреста (в примере II.4 эти же данные были использованы в умышленно рандомизированном виде, чтобы не сказывался эффект сопряженности тест - объектов). По формулам II.3.13 - II.3.16 (получаем):

Е = (-90 - 66 - 68 - 101)/4 = -81,25;

F = (-90 + 66 + 68 - 101)/4 = -14,25;

V = (1178 + 104 + 258 + 546)/(8 х 3 х 2) = 43,46;

2

А = 43,46/2 = 21,73; В = 43,46/(2 х 0,602 ) = 59,96

(I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602);

кроме того, f = 4 х 2 = 8, t (95%, 8) = 2,306.

Теперь по формулам II.3.5-II.3.10 находим:

Ь = -81,25/0,602 = -135,0;

0

M = -14,25 / (-135,0) = 0,1056; D /D = 127,6%;

2 2

g = 59,96 х 2,306 / (-135,0) = 0,0175; 1 - g = 0,9825;

0,1056

М = ------ +/-

H,B 0,9825

--------------------------------

2,306 / 2

+/- ---------------- \/ 21,73 х 0,9825 + 59,96 х 0,1056 =

- 135,0 х 0,9825

= 0,1075 +/- 0,0816 = [0,0259; 0,01891];

0

(D /D) = [106,1%; 154,6%].

H,B

0

Доверительный интервал для D /D получился более узким, чем без

учета сопряженности тест - объектов (см. пример II.4), хотя

использовано меньше результатов испытаний.

Когда имеются результаты нескольких независимых определений

эквивалентных доз, их можно объединить с целью получения более

0

точной оценки для D /D и более узкого доверительного интервала для

этой величины. При этом пользуются приближенными формулами (точные

формулы весьма громоздки):

_

_ M

M = ------ +/- t(P, f)S , (II.3.17)

H,B 1 - g M

_

M Mj

------ = SUM (Wj -----) / SUM Wj; (II.3.18)

1 - g 1 - g

j

-------

S = 1 / \/ SUM Wj, (II.3.19)

M

2

где весовыми коэффициентами Wj, служат обратные дисперсии 1 / s :

Mj

2 2

b (1 - g )

1 j j

Wj = ---- = -------------------; (II.3.20)

2 2

s Aj(1 - g ) + BjMj

Mj j

j = 1, 2, ..., k есть номер испытания, a t(P, f) берется для числа

степеней свободы, равного сумме чисел степеней свободы отдельных

испытаний: f = SUM f . Доверительный интервал для усредненного

0 j

отношения D /D находят по формуле:

_

(D0/D) = antilg(2 + M ). (II.3.21)

H,B H,B

Законность указанного объединения (т. е. случайности различия

между отдельными М) проверяют при помощи критерия "хи - квадрат":

2 ┌ ┐2

2 Mj │ Mj │

"хи" = SUM (Wj --------- ) - │SUM (Wj ------)│ / SUM Wj (II.3.22)

2 2 │ 1 - g │

(1 - g ) └ j ┘

j

2 2 2

должно быть "хи" < "хи" (95%, f), где "хи" (95%, f) берут из

табл. II

Таблица II.3.3

┌──────┬───────────────┬───────────────┬──────┬───────────────┬────┐

│Группа│1-й день опыта │2-й день опыта │"ДЕЛЬ-│d = "ДЕЛЬТА" - │ 2 │

│ │ │ │ТА" │ ______ │d │

│ │ │ │ │- "ДЕЛЬТА" │ │

├──────┼───────────────┼───────────────┼──────┼───────────────┼────┤

│1 │ 370│ 273│- 97 │- 7 │49 │

│ │ 0 │ │ │ │ │

│ │y1 342│y2 279│- 63 │ 27 │729 │

│ │ 0 │ │ │ │ │

│ │D1 = 0,1 ЕД 335│D2 = 0,4 ЕД 225│- 110 │- 20 │400 │

│ │ │Сумма │- 270 │ 0 │1178│

│ │ │Среднее │- 90 │ │ │

│2 │ 255│ 313│ 58 │- 8 │64 │

│ │ 0 │ │ │ │ │

│ │y2 268│y1 340│ 72 │ 6 │36 │

│ │ 0 │ │ │ │ │

│ │D2 = 0,4 ЕД 284│D = 0,1 ЕД 352│ 68 │ 2 │4 │

│ │ │Сумма │ 198 │ 0 │104 │

│ │ │Среднее │ 66 │ │ │

│3 │ 310│ 247│- 63 │ 5 │25 │

│ │ │ 0 │ │ │ │

│ │y1 356│y2 296│- 60 │ 8 │64 │

│ │ │ 0 │ │ │ │

│ │D1 = 0,1 ЕД 345│D2 = 0,4 ЕД 264│- 81 │- 13 │169 │

│ │ │Сумма │ 204 │ 0 │258 │

│ │ │Среднее │- 68 │ │ │

│4 │ 276│ 369│ 93 │- 8 │64 │

│ │ │ 0 │ │ │ │

│ │y2 228│y1 318│ 90 │- 11 │121 │

│ │ │ 0 │ │ │ │

│ │D2 = 0,4 ЕД 252│D1 = 0,1 ЕД 372│ 120 │ 19 │361 │

│ │ │Сумма │ 303 │ 0 │546 │

│ │ │Среднее │ 101 │ │ │

└──────┴───────────────┴───────────────┴──────┴───────────────┴────┘

приложения для числа степеней свободы f = k - 1 (k - число объединяемых испытаний). В частности, когда объединяются результаты двух испытаний, то

┌ M1 M2 ┐

W1W2│------ - ------ │

2 └1 - g1 1 - g2 ┘

"хи" = ------------------------- (II.3.23)

W1 + W2

2

при f = 1, так, что "хи" (95%, 1) = 3,84.