Опыт 2. Определение количества глюкозы в крови ортотолуидиновым методом.

Количество глюкозы в крови является одним из основных показателей углеводного обмена. Нормальное содержание глюкозы в крови у взрослого человека довольно постоянно и колеблется от 3,33 до 5,55 ммоль/л (60-100 мг%), а в плазме крови – 3,88-6,105 ммоль/л (70-110 мг%). Количественное определение глюкозы в крови очень важно для диагностики ряда заболеваний: сахарного диабета, нарушений функций печени, почек, надпочечников, наследственных энзимопатий.

Принцип метода. Определение содержания сахара в крови по цветной реакции с ортотолуидином предложено Hulmann^ом. Метод основан на способности глюкозы реагировать при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты с образованием соединения окрашенного в сине-зеленый цвет:

ортотолуидин + глюкоза соединение сине- зеленого цвета

+ Н₂О

Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации глюкозы и может быть определена колориметрически. С ортотолуидиновым реактивом реагируют и другие альдогексозы, но содержание их в крови невелико, поэтому метод позволяет определить практически одну глюкозу.

Порядок выполнения работы.

а) Осаждение белков крови трихлоруксусной кислотой.

В две центрифужные пробирки (опытную и контрольную) наливают по 0,9 мл 3%-го раствора трихлоруксусной кислоты. В опытную пробирку добавляют микропипеткой 0,1 мл крови (или сыворотки крови), а в контрольную – 0,1 мл стандартного раствора глюкозы (100 мг%). Содержимое пробирок перемеши-вают и пробы центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об./мин.

Во избежание взмучивания осадка на следующем этапе анализа центрифугат из опытной пробирки можно осторожно переливают в сухую чистую пробирку.

б) Цветная реакция с ортотолуидином.

В две сухие обыкновенные пробирки переносят по 0,5 мл центрифугата из опытной и контрольной пробы. Затем очень осторожно добавляют мерной пробиркой по 4,5 мл ортотолуи-динового реактива (работу выполняют в вытяжном шкафу с включенной тягой!). Содержимое каждой пробирки осторожно перемешивают стеклянной палочкой, пробирки закрывают кусочками фольги и помещают в бурно кипящую водяную баню точно на 8 минут. После этого пробирки охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры.

в) Определение оптической плотности.

Оптическую плотность опытной и стандартной проб измеряют на фотоэлектроколориметре с красным светофильт-ром (длина волны 670 нм) в кюветах на 10 мм против дистиллированной воды.

Оформление работы:

1. Рассчитайте количество глюкозы в исследуемой крови по формуле:

С_ст х Е_оп

С_оп =  ,

Е_ст

где С_оп – концентрация глюкозы в крови (в мг%);

С_ст – концентрация стандартного раствора глюкозы (100 мг%);

Е_оп – оптическая плотность опытной пробы;

Е_ст – оптическая плотность стандартной пробы.

2. Сделайте перерасчет полученного результата в единицах СИ, используя коэффициент 0,0555, так как 1 мг% концентра-ции глюкозы соответствует 0,0555 ммоль/л.

Сравните полученные результаты с нормальными показателями сахара в крови.

Опыт 3. Влияние физической нагрузки на содержание глюкозы в крови.

Принцип метода. Концентрация глюкозы в крови контролируется центральной нервной системой и железами внутренней секреции. Поэтому в здоровом организме возможны лишь кратковременные колеба-ния уровня глюкозы в крови. Так, гипергликемия наблюдается при сильном эмоциональном возбуждении (испуг, радость, страх, плач и т.д.), стрессовых реакциях, болевых приступах. Умереная гиперглюкоземия возникает после физической нагрузки. В этих случаях повышение концентрации сахара в крови связано с выбросом в кровь значительных количеств адреналина, который усиливает распад гликогена в печени.

Порядок выполнения работы.

У испытуемого (добровольца) берут из пальца 0,1 мл крови. Определяют количество глюкозы в крови ортотолуидиновым методом (см. работу 7), затем он выполняет физические упражнения (например, 50-60 приседаний), и через 15-20 минут у него снова берут 0,1 мл крови из пальца для анализа.

Оформление работы: рассчитайте количество глюкозы в крови до и после физической нагрузки (расчет смотрите в работе – Опыт 2.), Сравните полученные результаты и объясните причину гипергликемии после физической нагрузки.

Опыт 4. Приготовление безбелкового мышечного экстракта.

Порядок выполнения работы.

Мышечную ткань (1 г) тщательно растирают в течение 3-5 минут в ступке с 1мл дистиллированной воды до получения гомогенной кашицы. Затем добавляют 4 мл воды и тщательно растирают еще несколько минут. Содержимое ступки фильтруют через два слоя марли, фильтрат переносят в пробирку и кипятят до появления осадка. Осадок фильтруют, а фильтрат используют для анализа. Фильтрат носит название безбелковый мышечный экстракт, в его составе полностью отсутствуют белки, но сохранились экстрактивные вещества, в частности, креатин и молочная кислота.