Опыт 1. Количественное определение глюкозы в биологических жидкостях.

В организме человека и животных углевод содержатся в значительно меньших количествах, чем у растений (не более 2% от сухой массы), так как основной их функцией является энергетическая. Энергия, выделяющаяся при расщеплении углеводов, аккумулируется в макроэргических связях АТФ и обеспечивает все процессы жизнедеятельностиорганизмов. Углеводы также являются исходными продуктами для синтеза других органических соединений. Из промежуточных продуктов их расщепления, таких как 3-фосфоглицериновый альдегид, пировиноградная кислота (ПВК), ацетил-КоА, в организмах могут образовываться компоненты липидов (глицерин и высшие жирные кислоты), белков (заменимые аминокислоты) и нуклеиновых кислот (пентозы).

Несмотря на постоянное потребление глюкозы из крови тканями и поступление её из кишечника после приема пищи, содержание глюкозы в крови постоянно и колеблется в пределах 3,3–5,5 ммоль/л (60–100 мг/л). Это постоянство поддерживается в результате сложных механизмов регуляции, которые находятся под контролем центральной нервной системы. Важнейшую роль в этой системе играют гормоны. Так, адреналин и глюкагон повышают содержание глюкозы в крови, а инсулин понижает её.

Принцип метода. Для количественного определения глюкозы в биологических жидкостях применяют фотоэлектроколориметрический метод. Он основан на определении степени интенсивности окрашивания раствора, образующегося при взаимодействии глюкозы с ортотолуидиновым реактивом (в 94 мл ледяной уксусной кислоты растворяют 0,15 г тиомочевины и добавляют 6 мл ортотолуидина). Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации глюкозы. При помощи этого метода глюкозу можно определить только при отсутствии белков, поэтому их предварительно осаждают 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХК).

Этот метод является специфичным и точным. Он даёт возможность определять истинную глюкозу, так как другие редуцирующие вещества (глюкуроновая кислота, аскорбиновая кислота и др.) с ортотолуидиновым реактивом окрашивания не дают. Взаимодействие глюкозы с ортотолуидином выражается следующей реакцией:

O CH₃



CH N CH

 

CH₃ HCOH HCOH

 

HOCH HOCH

 

NH₂ + HCOH HCOH

 + Н₂О 

HCOH HCOH

 

CH₂OH CH₂OH

ортотолуидинглюкозасоединение сине- зеленого цвета

Порядок выполнения работы.

Опыт 1.1. Приготовление мышечного экстракта.

На технических весах взвешивают 10 г мышечной ткани свежей рыбы или мяса и помещают в охлажденную, стоящую на льду ступку. Отмеряют 50 мл

охлажденного 0,04 М раствора никотинамида и заливают им взятую навеску.

Затем мышцы измельчают ножницами, добавляют кварцевый песок, растирают в ступке до получения гомогенной массы и экстрагируют 30–40

мин. После этого полученный экстракт переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3 000 об/мин в течение 10 мин. Полученный экстракт используют в качестве исходного материала для определения глюкозы.

Опыт 1.2. Получение безбелкового фильтрата.

В микропипетку набирают 0,5 мл полученного экстракта или другого биологического раствора (например, крови или мочи), вносят его в центрифужную пробирку и добавляют 0,5 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. (Осторожно! Это едкое вещество.) При наличии белка раствор мутнеет. Содержимое пробирки перемешивают, переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3 000 об/мин в течение 5 мин.

Белок при этом осаждается. Безбелковый фильтрат (он должен быть про зрачным) сливают и используют для последующего анализа.

Опыт 1.3. Количественное определение глюкозы.