Опыт 1.3.1. Определение оптической плотности глюкозы в полученном фильтрате.

В микропипетку набирают 0,2 мл полученного фильтрата, переносят его в высокую тонкостенную сухую пробирку и добавляют 2 мл ортотолуидинового реактива (раствор о-толуидина в уксусной кислоте). Работают осторожно, под тягой, так как о-толуидин является ядовитым веществом. Пробирку закрывают алюминиевой фольгой и помещают точно на 8 мин в кипящую водяную баню, следя за тем, чтобы вода всё время кипела. После этого достают пробирку из водяной бани и быстро охлаждают в токе холодной воды до 20º С. Её содержимое переносят в кювету на1 см и фотометрируют при длине волны 630 нм против раствора сравнения.

Полученные данные записывают в таблицу.

Значение оптической плотности глюкозы

№ пробирки	Фильтрат, мл	Калибровочный раствор, мл	Реактив, мл	Д (оптическая плотность)
1	0,20	-	2,0
2	-	0,20	2,0

Раствор сравнения готовят, смешивая 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 2 мл ортотолуидинового реактива, но в качестве его обычно используют воду. Это связано с тем, что в ТХК не содержится даже следов глюкозы, поэтому окраска с ортотолуидиновым реактивом не развивается. Для

Получения точных данных измерение должно быть проведено не позже 30 мин после охлаждения пробирок!

Опыт 1.3.2. Определение оптической плотности глюкозы в калибровочном растворе.

Готовят калибровочный раствор глюкозы с концентрацией10 ммоль/л. Для этого к 0,2 мл эталонного раствора глюкозы (концентрация 25 ммоль/л) прибавляют 0,3 мл дистиллированной воды. Определение оптической плотности полученного раствора ведут аналогично определению оптической плотности глюкозы в полученном фильтрате (п. 1.3.1.) и параллельно ему. Эталон и раствор сравнения не центрифугируют. Пробу и калибровочный раствор можно отмерять одной и той же микропипеткой. Результат определения записывают в таблицу.

При повышенных концентрациях глюкозы, особенно при анализе мочи, пробу необходимо разводить 2 и даже 10 раз дистиллированной водой. Дальнейший ход работы остается без изменений, а результаты анализа умножают на число разведений.

Опыт 1.4. Определение содержания глюкозы.

Содержание глюкозы рассчитывают по формуле:

А

Х=⋅ 10,

Б

где X – содержание глюкозы, ммоль/л;

А – оптическая плотность пробы;

В – оптическая плотность эталона;

10 – концентрация глюкозы в калибровочном растворе, ммоль/л.

Для определения содержания глюкозы в мг используют следующее отношение: ммоль/л = 0,0555 мг/100 мл.

При нормальных и повышенных концентрациях глюкозы ошибка определения составляет около ±2%, а при пониженных её концентрациях ошибка составляет около ±7–8%.

Для достижения правильных результатов необходимо строго соблюдать постоянство условий нагревания. Растворы должны нагреваться в одинаковых пробирках, иначе нагревание будет неравномерным. В случае необходимости объем пробы, а также объем всех других растворов можно увеличить вдвое.

Полученные результаты опыта , включая уравнения протекающих реакций, экспериментальные данные, расчёты и выводы записать в тетрадь.