Тема 3,4. Основные закономерности метаболизма. Цикл Кребса. Молекулярные основы биоэнергетики

Метаболизмом называют всю совокупность химических реакций в живых клетках. В более узком смысле "метаболизм" означает промежуточный обмен, то есть превращение веществ внутри клеток с момента их поступления до образования конечных продуктов. Промежуточные продукты называют метаболитами или интермедиатами.

Центральные метаболические пути сходны у всех живых форм (принцип биохимического единства) и обеспечивают: а) приток химической энергии за счет расщепления пищевых веществ или преобразования энергии солнечного света; б) синтез строительных блоков для построения макромолекул и в) сборку клеточных компонентов.

Промежуточный обмен складывается из двух фаз: катаболизм и анаболизм. В ходе катаболизма происходит расщепление сложных органических молекул до более простых конечных продуктов, что сопровождается запасанием значительной части свободной энергии в высокоэнергетических (макроэргических) соединений. Анаболические процессы включают биосинтез строительных блоков и макромолекулярных компонентов клетки, что сопрягается с реакциями распада макроэргических соединений (прежде всего, нуклеозидтрифосфатов). Скорости катаболических и анаболических реакций тонко регулируются в соответствии с потребностями организма и условиями внешней среды.

Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса) является амфиболическим путем. Амфиболический путь сочетает в себе катаболические и анаболические реакции. В цикле Кребса осуществляются не только окислительные превращения энергетических субстратов до конечных продуктов, но и происходит образование субстратов для других метаболических путей.

Процессы катаболизма в клетках животных сопровождаются потреблением кислорода, который необходим для реакций окисления. Электроны и протоны на первом этапе переходят от органических субстратов на коферменты NAD- и FAD-зависимых дегидрогеназ, а далее переносятся на кислород через цепь переносчиков, организованных в дыхательную цепь митохондрий. Кислород при этом восстанавливается до воды.

Согласно хемиосмотической теории I, III и IV белковые комплексы дыхательной цепи при переносе электронов выкачивают протоны из матрикса митохондрий в межмембранное пространство, создавая электрохимический потенциал, который далее используется АТФ-синтетазой для окислительного фосфорилирования. При окислении NADH(H⁺) величины потенциала достаточно для синтеза 3 молекул АТФ, при окислении FADH₂ – 2 ATФ. Зависимость интенсивности дыхания митохондрий от концентрации АДФ называют дыхательным контролем.

Многие заболевания людей и животных связаны с нарушением энергетического обмена. Так как для нормального протекания процессов жизнедеятельности необходима энергия, то нарушение энергообеспечения влияет на многие функций организма.

Нарушение энергетических процессов может быть связано с недостаточностью субстратов окисления (углеводов, аминокислот, жирных кислот и др.), с невозможностью их использования, с недостаточностью ферментов дыхательной цепи, в том числе из-за нехватки витаминов, входящих в ее состав или являющихся предшественниками коферментов, с блокированием процессов окислительного фосфорилирования и образования АТФ, с уменьшением активности Н⁺-АТФ-синтеза, с токсическими поражениями, при которых нарушается проницаемость митохондриальных мембран, с дефицитом кислорода.

Нарушение регуляции энергетических процессов наблюдают при гипогликемии, когда снижается содержание глюкозы в крови – важного источника энергии в организме. Это состояние может быть вызвано голоданием, тяжелой физической нагрузкой, потреблением алкоголя. Гипогликемия неблагоприятно влияет на функции мозга: развивается гипогликемический шок, потеря сознания, спазмы сосудов головного мозга, температура тела снижается.

Еще один пример патологии, обусловленной нарушением энергетического обмена, – лихорадка. Повышение температуры тела связано, как правило, с бактериальной или вирусной инфекцией. Лихорадку вызывают вещества пирогены, выделяемые бактериями, которые разъединяют тканевое дыхание и фосфорилирование. При этом уменьшается образование АТФ и энергия, которая не используется для фосфорилирования АДФ выделяется в виде тепла.

Развитие патологий характерно непосредственно для самого аппарата энергообеспечения, в частности, для митохондрий (митохондриальные болезни, при которой заметно снижается активность ферментов биологического окисления. Наблюдаются при некоторых гормональных расстройствах).

Энергетический обмен – суммарный показатель интенсивности метаболизма, поэтому его изменения из-за различного влияния окружающей среды можно использовать для анализа приспособленности обменных процессов организма. Стресс, вызванный разнообразным влиянием (тепло, холод, рентгеновское излучение, травма, воспаление), через посредничество центральной нервной и эндокринной системы приводит к интенсификации метаболических процессов в организме, в том числе – к увеличению уровня энергетического обмена.

Лабораторная работа 8. Исследование сукцинатдегидрогеназы мышц

Сукцинатдегидрогеназа мышц – это железофлавопротеин, катализирующий окисление (дегидрирование) янтарной кислоты в фумаровую. Коферментом сукцинатдегидрогеназы служит флавинадениндинуклеотид (ФАД). Активность фермента зависит от наличия в нем свободных сульфгидрильных групп и атомов железа.

В качестве источника фермента используется отмытая мышечная ткань. Действие этого фермента можно выявить при добавлении к янтарной кислоте метиленового синего или 2,6-дихлорфенолиндофенола, выступающие в качестве акцептора водорода, и, восстанавливаясь, обесцвечиваются.

Конкурентное торможение активности этого фермента вызывает малоновая кислота НООС – СН₂ – СООН, являющаяся структурным аналогом янтарной кислоты.

Материалы и реактивы: свежая мышечная ткань, 0,01 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ), 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), 0,1 N раствор едкого натрия, 3 % раствор малоновой кислоты.

Ход работы. Свежую мышечную ткань (1 г) измельчить ножницами и растереть в ступке с небольшим количеством воды (2-3 мл) в течение 1 мин. Полученный гомогенат перенести на двойной слой марли, размещенной на воронке, промыть водой, высушить на фильтровальной бумагу и высушить.

В три пробирки налить по 3 мл фосфатного буфера и поместить в них по 0,1 г мышечного гомогената. Затем в опытную пробирку добавить 5 капель 3 % раствора янтарной кислоты и, для нейтрализации, 5 капель 0,1 N раствора едкого натрия, а в контрольную – 10 капель дистиллированной воды. В третью пробирку добавить 5 капель 3 % раствора малоновой кислоты, 5 капель 3 % раствора янтарной кислоты и 5 капель 0,1 N раствора едкого натрия. Во все пробирки добавить по 1 мл 0,001 н раствора 2,6-ДХФИФ. Хорошо перемешать. Пробы поместить в термостат при 37 ⁰С на 40 мин.

Наблюдается обесцвечивание содержимого в первой пробирке. Сравнить ее с контролем и пробиркой, в которой находился конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы – малоновая кислота. Время обесцвечивания 2,6- ДХФИФ при наличии янтарной кислоты характеризует активность сукцинатдегидрогеназы.

Лабораторная работа 9. Исследование цитохромоксидазы мышц

Цитохромоксидаза – фермент, относящийся к оксидоредуктазам. Она завершает дыхательную цепь, окисляя цитохром с путем переноса электронов на кислород воздуха. По химической природе цитохромоксидаза – это медьгемопротеин, то есть в простетической его части содержится гем, а в нём медь.

Выявление цитохромоксидазы основана на ее способности окислять при участии кислорода воздуха не только цитохромы, но и некоторые органические соединения, в частности, парафенилендиамин и -нафтол (реактив НАДИ). При окислении двух последних соединений образуется окрашенный продукт – индофенол синий.

Материалы и реактивы: мышечная ткань, 1 % водный раствор n-фенилендиамина, 1 % спиртовой раствор -нафтола.

Ход работы. 1. Взять 0,5-0,7 г свежей мышечной ткани, измельчить ножницами, поместить в ступку с 20-кратным объемом дистиллированной воды и растереть в течение 10 мин. Воду осторожно слить, а твердый остаток фильтровать через двойной слой марли. Мышечный гомогенат промывать водой, пока она не будет прозрачной.

2. Отмытый от водорастворимых ферментов гомогенат из мышечной ткани делить на две части. Одну часть поместить на фильтровальную бумагу, а вторую – в пробирку, куда добавить 1 мл дистиллированной воды и кипятить 1 мин. После охлаждения жидкость осторожно слить в пробирку, оставшийся мышечный гомогенат перенести стеклянной палочкой на фильтровальную бумагу.

3. На оба кусочка мышц нанести по 1-2 капли индофенольного реактива "НАДИ". Через 5-10 мин на кусочке, который не кипятили, появляется сине-фиолетовая окраска как результат реакции окисления и конденсации -нафтола и парафенилендиамина. Эта реакция катализируется цитохромоксидазой мышц. На прокипяченном кусочке мышц реакция отрицательная из-за тепловой денатурации фермента.

Контрольные вопросы по теме ”Основные закономерности обмена веществ. Цикл трикарбоновых кислот”:

1. Обмен веществ (метаболизм)– общие закономерности протекания катаболических и анаболических процессов.

2. Общие стадии внутриклеточного катаболизма биомолекул: белков, углеводов, липидов.

3. Цикл трикарбоновых кислот. Локализация, последовательность ферментативных реакций, значение в обмене веществ.

4. Энергетический баланс цикла трикарбоновых кислот. Физиологическое значение реакций ЦТК.

Контрольные вопросы по теме ”Молекулярные основы биоэнергетики”:

1. Реакции биологического окисления, типы реакций (дегидрогеназные, оксидазные, оксигеназные) и их биологическое значение. Тканевое дыхание.

2. Ферменты биологического окисления в митохондриях: пиридин- , флавинзависимые дегидрогеназы, цитохромы.

3. Последовательность компонентов дыхательной цепи митохондрий. Молекулярные комплексы внутренних мембран митохондрий.

4. Окислительное фосфорилирование: пункты сопряжения транспорта электронов и фосфорилирования, коэффициент окислительного фосфорилирования.

5. Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования, АТФ-синтетаза митохондрий.

6. Ингибиторы транспорта электронов и разобщители окислительного фосфорилирования.

МОДУЛЬ 2. МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ, ЛИПИДОВ, АМИНОКИСЛОТ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ