Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
МЕТОДИЧКА ФФМ.doc
Скачиваний:
202
Добавлен:
13.03.2016
Размер:
991.74 Кб
Скачать

Белки. Состав и свойства белков

Белки или протеины – высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков ,L-аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки синтезируются из 20 видов -аминокислот. Пептидная связь образуется при взаимодействии -карбоксильной группы одной аминокислоты с -аминогруппой другой аминокислоты. Полимеры, которые содержат до 50 аминокислотных остатков, называют пептидами. К белкам относят полипептиды, содержащие от 50-100 до нескольких тысяч аминокислотных остатков.

Белки относятся к гетерополимерам. Огромное разнообразие белков в природе обусловлено разной последовательностью более чем 20 видов остатков аминокислот в поли­пептидном остове (первичная структура белка). Различия в первичной структуре отражаются на пространственной организации белковой молекулы.

Правильное чередование жёстких пептидных и гибких ординарных связей в цепи главных валентностей создают возможность для укладки полипептидной цепи в упорядоченную структуру типа спирали, которая стабилизирована водородными связями между пептидными группировками (вторичная структура). Если молекула белка образует непрерывную спираль, то данный белок является фибриллярным.

Если в молекуле имеются аморфные, неспирализованные, участки, то становится возможным дальнейшее сворачивание полипептидной цепи в пространстве за счет взаимо­действия аминокислотных радикалов (третичная структура). Такие белки относятся к глобулярным. Характер связи (водородные, электростатические, ван-дер-ваальсовы, гидрофобные, ковалентные) между аминокислотными радикалами зависит от их химической природы. В результате полипептидная цепь сворачивается очень сложным, но вместе с тем строго определенным образом, приобретая характерное пространственное строение.

Межмолекулярные взаимодействия между отдельными полипептидными цепями, обладающими вторичной и третичной структурой, могут при их нестабильности в соответствующих условиях приводить к образованию олигомерных белков с четвертичной структурой.

Пространственная структура белковой молекулы, поддерживаемая совокупностью слабых связей, очень лабильна и легко изменяется под влиянием различных физических и химических воздействий, в результате чего изменяются ее физико-химические и биологические свойства. Некоторые физические факторы (температура выше 50—55°С, разные виды ионизирующего излучения, изменение полярности среды) и действие ряда химических агентов (соли тяжелых металлов, минеральные и органические кислоты, алкалоидные реактивы) вызывают потерю нативной конформации (упорядоченной пространственной укладки), т.е. денатурацию белка (за счет нарушения третичной и вторичной структуры). Денатурация белка сопровождается потерей его биологической активности и изменением многих физико-химических свойств белка, в том числе может резко снижаться растворимость, увеличивается вязкость, изменяется электрофоретическая подвижность, возникает склонность к агрегации молекул. Первичная структура белка при денатурации не изменяется.

К реакциям осаждения белков прибегают при выделении белков из тканей, при разделении смесей белков, а также для обнаружения их в различных биологических жидкостях. Осаждение белков бывает обратимым и необратимым. При обратимом осаждении белок можно перевести в растворенное состояние, удалив осадитель или снизив его концентрацию, при этом белок сохраняет свои нативные (естественные) свойства. Обратимое осаждение белков наблюдается при добавлении в больших концентрациях солей щелочных и щелочно-земельных металлов, а также аммонийных солей, например сульфата аммония. Такое осаждение, при котором происходит дегидратация белковых молекул с одновременной нейтрализацией их зарядов, называется высаливанием. Белки, в зависимости от их -потенциалов, прямо пропорциональных зарядам и обратно пропорциональных радиусам, осаждаются (высаливаются) растворами солей различ­ной концентрации.

При необратимом осаждении осадок белка не переходит в раствор при удалении осадителя или повышении концентрации первоначального растворите­ля, что, как правило, обусловлено денатурацией белка. Способность денатурирующих агентов вызывать необратимое осаждение белков используется для обнаружения белков в биологических объектах (белок мочи в клиническом анализе), удаления белка из биологических жидкостей при определении в них содержания сахара, минеральных компонентов, аминокислот и т.д.

Лабораторная работа 2. Качественные реакции на белки и аминокислоты

Присутствие белка в биологических образцах или растворах можно обнаружить с помощью цветных реакций, которые обусловлены наличием пептидных связей или специфических групп аминокислот. Данные реакции используются в аналитике для выявления белков и определения их аминокислотного состава. С помощью цветных реакций можно выявить сравнить аминокислотный состав глобулярных и фибриллярных белков.

В качестве примера глобулярных белков могут использоваться белки сыворотки крови. Представителем фибриллярных белков является коллаген, продукт частичного гидролиза которого – желатин – в данной работе сравнивается с глобулярными белками сыворотки.

По результатам цветных реакций заполнить таблицу.

Название реакции

Чем обу­словлена

Цвет, вид

Сыворотка (+/–)

Желатин (+/–)

1. Биуретовая

2. Нингидриновая

3. Ксантопротеиновая

4. Адамкевича

5. Эрлиха

6. Сакагучи

7. Фоля

Сделать вывод об аминокислотном составе исследованных белков и их возможной пищевой ценности.

Работа 1. Биуретовая реакция

Обусловлена наличием в белках и пептидах пептидных группировок, которые в щелочной среде образуют с сернокислой медью окрашен­ные в сине-фиолетовый цвет комплексы.

Ход работы. Взять 2 пробирки, в одну налить 0,5 мл раствора сыворотки крови, во вторую – 0,5 мл раствора желатина. В каждую пробирку добавить по 3-4 капли 10%-ного раствора NaOH и 1-2 капли 1%-ного раствора Сu24 и перемешать.

Работа 2. Нингидриновая реакция

Обусловлена наличием свободной -аминогруппы у всех белков, пептидов и -аминокислот. При нагревании с нингидрином эти вещества окисляются с образованием СО2, NН3 и соответствующих альде­гидов. Нингидрин при этом восстанавливается и конденсируется с NH3 и избытком гидратированной кетоформы нингидрина, образуя комплекс сине-фиолетового цвета.

Ход работы. В 2 пробирки внести по 0,5 мл сыворотки крови и желатина, добавить по 5 капель 0,5% раствора нингидрина, перемешать и нагреть до кипения.

Работа 3. Ксантопротеиновая реакция

Обусловлена наличием в большинстве белков ароматических аминокислот, которые при нагревании с азотной кислотой подвергаются нитрованию. Образующиеся нитропроизводные аминокислот окрашены в желтый, а в щелочной среде - в оранжевый цвет.

Ход работы. В 2 пробирки внести по 0,5 мл сыворотки крови и желатины. Добавить по 0,5 мл концентрированной НNO3 и осторожно (!) нагреть. В случае появления желтого окрашивания охладить смесь и добавить 30% раствор NaOH пo каплям до появления оранжевой окраски.

Работа 4. Реакция Адамкевича на триптофан

Триптофан в кислой среде взаимодействует с альдегидами, давая окрашенные продукты конденсации. Ледяная уксусная кислота может служить в качестве источника глиоксиловой кислоты, необходимой для этой реакции.

Ход работы. В 2 пробирки внести по 0,5 мл сыворотки крови и желатины. Добавить в каждую по 0,5 мл концентрированной уксусной кислоты, слегка нагреть. После охлаждения по стенке подслоить 1 мл концент­рированной H2SO4 до появления красно-фиолетового кольца.

Работа 5. Реакция Эрлиха на гистидин

При смешивании растворов 1 (сульфаниловая кислота в НС1) и 2 (NaNO2 в воде) друг с другом и с аммиаком образуется диазобензолсульфоновая кислота, дающая оранжевое окрашивание с гистидином.

Ход работы. В 2 пробирки внести по 0,5 мл сыворотки крови и желатины. Добавить по 0,5 мл реактива 1, по 1-2 капли реактива 2 и NH4OH (или NаОН) до щелочной реакции.

Работа 6. Реакция Сакагучи на аргинин

В присутствии щелочи гуанидиновая группировка аргинина окисляется гипобромитом или гипохлоридом. Далее окисленный аргинин, соединяясь с - нафтолом, дает продукт, окрашенный в красный цвет.

Ход работы. Внести в 2 пробирки по 0,5 мл сыворотки крови и желатины, добавить по 0,5 мл 10% раст­вора NaOH, по 5 капель 0,1% раствора -наф­тола в спирте и по 1-5 капель раствора гипобромита.

Работа 7. Реакция Фоля на серусодержащие аминокислоты

Цистин, цистеин, метионин при нагревании с концентрированными раство­рами щелочей разрушаются с образованием сульфидов. При добавлении ацетата свинца образуется сернистый свинец (сульфид свинца), выпадающий в осадок черного цвета.

Особо богаты цистеином фибриллярные белки, входящие в состав волос и ногтей.

Ход работы. Взять 3 пробирки: в одну внести 5 капель сыворотки крови, в другую – 5 капель желатины, в третью – налить 0,5 мл воды и опустить кусочек ногтя или волос. Добавить в каждую по 10 капель 30% раствора NаОН и по 1 капле 5% раствора (CH3COO)2Pb. Нагреть до кипения и осторожно кипятить 1-2 мин.

Лабораторная работа 3. Осаждение белков

В данной лабораторной работе исследуется действие нескольких групп осадителей.

По результатам работ оформить таблицу.

Вид осадителей

Реактив

Осадок (+/-)

Обрати­мость(+/-)

Минеральные

кислоты

H2SO4

HCl

HNO3

Органические

кислоты

Трихлоруксусная к-та

Сульфосалициловая к-та

Алкалоидные

реактивы

Пикриновая к-та

Таннин

Соли тяжелых металлов

CuSO4

(CH3COO)2Pb

Органические растворители

Спирт

Ацетон

Соли щелочно-земельных металлов и аммония

(NH4)2SO4

Для проверки обратимости осаждения в каждой группе необходимо выбрать пробирку с наибольшим осадком и добавить 2 мл дистиллированной воды для снижения концентрации осадителя.

Сделать вывод о том, какие из исследованных осадителей вызывают необратимое, а какие - обратимое осаждение белков.

Работа 1. Осаждение белков минеральными кислотами

В 3 пробирки внести по 0,5 мл раствора белка (сыворотки крови или яичного белка, разведенного водой в соотношении 1:20) и добавить по 1-2 капли следующих концентрированных растворов кислот: Н24, НСl, НNО3. Перемешать.

Работа 2. Осаждение белка органическими растворителями

В 2 пробирки внести по 0,5 мл раствора белка и добавить в одну 0,5 мл спирта, в другую - столько же ацетона. Перемешать.

Работа 3. Осаждение белка органическими кислотами

В 2 пробирки внести по 0,5 мл раствора белка и добавить в одну 0,5 мл 10% раствора трихлоруксусной, в другую - 0,5 мл сульфосалициловой кислот. Перемешать.

Работа 4. Осаждение белка алкалоидными реактивами

В 2 пробирки внести по 0,5 мл раствора белка и добавить по 5 капель 1% раствора уксусной кислоты (в кислой среде взаимодействие белка с алкалоидными реактивами протекает более активно). Затем добавить в одну 5-7 капель пикриновой кислоты, в другую - 5-7 капель таннина. Перемешать.

Работа 5. Осаждение белка солями тяжелых металлов

В 2 пробирки внести по 0,5 мл раствора белка и добавить по 1-2 капли раствора CuSО4 , (СН3СОО)2Рb. Перемешать.

Работа 6. Осаждение белков солями щелочных и щелочно-земельных металлов

В пробирку внести по 0,5 мл раствора белка и добавить 0,5 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4. Перемешать.

Лабораторная работа 4. Высаливание как метод разделения белков сыворотки крови

Активность осаждения белков зависит от ионной силы солевого раствора (или конечной концентрации таких водоотнимающих средств, как спирт или ацетон) и -потенциала белка.

Глобулины сыворотки крови выпадают в осадок в полунасыщенном растворе сульфата аммония (50%), альбумин – при 75%-ном насыщении. Это позволяет осуществить фракционирование белков путем дробного их осаждения. Высаливание белков является обратимым процессом, и после удаления соли (путем диализа, при разбавлении водой или другими способами) белок вновь приобретает природные свойства, что используется для разделения, очистки белков и получения нативных белковых препаратов.

Ход работы. В пробирку 1 внести 2 мл раствора яичного белка или сыворотки крови. Добавить 2 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4 и переме­шать. В образовавшемся полунасыщенном растворе (NH4)2SO4 осаждаются глобулины, которые отделяют фильтрованием. К фильтрату добавить равный объем насыщенного раствора (NH4)2SO4, насыщая таким образом фильтрат данной солью на 75%. При данной концентрации (NH4)2SO4 осаждается альбумин, который также отделяют от раствора фильтрованием (фильтрат в пробирке 3). Полученные осадки собирают с фильтров, переносят в пробир­ки (4 и 5) и растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды (не более 1 мл) и проводят с полученными растворами, а также с фильтратом, полученным после отделения альбумина (пробирка 3), биуретовую реакцию. Делают вывод о наличии белка в данных фракциях.

Контрольные вопросы по теме “Введение в биохимию. Биохимические компоненты клеток”:

  1. Биологическая химия (биохимия) как наука. Место биохимии среди других медико-биологических дисциплин. Объекты изучения и задание биохимии. Ведущая роль биохимии в установлении молекулярных механизмов патогенеза болезней человека.

  2. Связь биохимии с другими биомедицинскими науками. Медицинская биохимия. Клиническая биохимия. Биохимическая лабораторная диагностика.

  3. Биохимические компоненты клетки, их биохимические функции. Классы биомолекул. Иерархия биомолекул, их происхождение.

  4. Что понимают под первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурами белка? Какие связи стабилизируют данные уровни структурной организации белка?

  5. Характеристика пептидной группировки.

  6. Каковы различия в аминокислотном составе глобулярных и фибриллярных белков?

  7. Что такое изоэлектрическая точка? На чем основаны методы ее определения?

  8. От чего зависит растворимость белков? Как влияет на растворимость заряд белковой молекулы, рН раствора?

  9. Каковы общие принципы осаждения белка из раствора?

  10. Что такое денатурация? Какие агенты ее вызывают? Какие уровни пространственной структуры белка нарушаются при денатурации?

  11. Каким способом можно осадить белки из раствора, не вызывая их денатурацию?

  12. Классификация сложных белков. Каковы важнейшие представители сложных белков и их функции?

  13. Классификация простых белков. Каковы важнейшие представители простых белков и их функции?