Тема 2. Метаболизм липидов и его регуляция

К липидам относят разнообразные слабополярные органические соединения, плохо растворимые в воде и растворимые в органических неполярных растворителях.

По химическому составу можно выделить несколько групп липидов: сложные эфиры спиртов и жирных кислот (ацилглицеролы, воска), сфинголипиды (сфингофосфолипиды и сфингогликолипиды), эйкозаноиды, стероиды и терпены. По свойствам выделяют также нейтральные липиды (триацилглицеролы, воска, стероиды) и полярные липиды (фосфо-, гликолипиды).

Жирные кислоты, являясь энергетически емкими молекулами, окисляются в организме с выделением энергии или запасаются в составе триацилглицеролов, главным образом в адипоцитах жировой ткани. Фосфо- и гликолипиды являются основными компонентами биомембран. Эйкозаноиды представляют собой производные полиненасыщенных жирных кислот (прежде всего, арахидоновой кислоты) и подразделяются по особенностям структуры и функций на простагландины, лейкотриены и тромбоксаны. Эйкозаноиды выполняют регуляторные функции. К стероидам относятся холестерин и его производные – желчные кислоты, стероидные гормоны, витамин D. Холестерин является необходимым компонентом клеточных мембран.

В организм человека и животных с пищей поступают, в основном, триглицериды (жиры и масла) и холестерин.

Расщепление триглицеридов (липолиз) протекает ступенчато с образованием промежуточных продуктов диглицеридов, моноглицеридов и жирных кислот. Эмульгирование жиров желчными кислотами в 12-перстной кишке облегчает переваривание и всасывание жирных кислот.

Внутриклеточный катаболизм липидов включает расщепление триглицеридов под действием тканевых липаз с последующим окислением глицерина (в гликолизе и далее в цикле Кребса) и жирных кислот (-окисление в митохондриях). Образующийся ацетил-КоА далее может окислиться в цикле Кребса или использоваться для синтеза других жирных кислот или холестерина. Значительная часть жирных кислот может использоваться для синтеза мембранных липидов.

Холестерин, поступающий с пищей и синтезированный в организме может включаться в мембранные структуры или использоваться для получения биологически активных производных, указанных выше.

Как и обмен углеводов, липидный обмен регулируется гормонально – адреналином, глюкагоном, инсулином. Инсулин активирует биосинтез жиров через увеличение содержания НАДФН, образующегося в пентозофосфатном пути. Адреналин и глюкагон, а также глюкокортикоиды активируют липазу жировой ткани и способствуют утилизации жиров.

Лабораторная работа 6. Определение содержания общих липидов в сыворотке крови

Содержание общих липидов в сыворотке крови является одним из показателей липидного обмена и часто используется для целей лабораторной диагностики.

Принцип метода: продукты распада ненасыщенных липидов образуют с ванилиновым реактивом окрашенные соединения. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации липидов в пробе и определяется колориметрически.

Материалы и реактивы:

1. Экстрагирующая смесь (95% этиловый спирт и этиловый эфир 3:1 по объему).

2. Концентрированная серная кислота (уд.вес 1,84).

3. Ванилиновый реактив: смесь 0,6% раствора ванилина и концентри­ро­ван­ной ортофосфорной кислоты (уд. вес 1,7) в соотношении 1:4 по объему.

4.Холестериновый эталон. Готовится разведе­нием стандартного раствора холестерина (50 г/л) в этиловом спирте в 10 раз хлороформом. Конечная концентрация 5 г/л.

Ход работы:

1-й этап: подготовка опытной пробы. Налить в пробирку 2 мл экстрагирующей смеси. Доба­вить 0,1 мл сыворотки крови. Закрыть пробкой. В течение 30 мин периодически встряхивать. Дать смеси отстояться. Отобрать 0,2 мл экстракта в сухую пробирку и выпарить.

2-й этап: подготовка стандартной пробы. 1 мл холестеринового эталона налить в сухую пробирку и выпарить.

3-й этап: кипячение на водяной бане. К опытной пробе, выпаренному холестериновому эталону и в пустую сухую пробирку (холостая проба) добавить по 0,4 мл концентрированной серной кислоты, пробирки закрыть пробками и поставить пробы в ки­пящую водяную баню на 10 мин. Пробирки при этом должны быть заткнуты пробками.

4-й этап: окрашивание. В каждую из 3-х пробирок добавить 4 мл вани­линового реактива, перемешать. Окраска развивается в течение 30 мин.

5-й этап: измерения и расчет. Колориметрировать опытную и стандартную пробы при 530 нм (желто-зеленый светофильтр) и длине оптического пути 0,5 или 1 см против холостой пробы. Сравнить оптическую плотность и определить концентрацию липидов в сыворотке крови. Выразить ее в г/л.

С = С_станд Е_опыт/Е_станд,

где С – концентрация холестерина в стандартной пробе (5 г/л),

Е_опыт и Е_станд – оптическая плотность опытной и стандартной пробы, соответственно.

Клинико-диагностическое значение. Содержание общих липидов в сыворотке крови здоровых людей составляет от 4 до 8 г/л. Физиологическая (алиментарная) гиперлипемия развивается через 2-3 ч после приема пищи богатой жирами и максимальных значений достигает через 4-6 ч.

Повышение содержания общих липидов в сыворотке крови наблюдается при ряде заболеваний: диабете (снимается введением инсулина), липоидном нефрозе, токсикозах, циррозе, остром гепатите, ожирении, атеросклерозе, ишемической болезни сердца, гипотериозе, панкреатите, злоупотреблении алкоголем, а также при голодании. Снижение содержания липидов в сыворотке крови обнаруживается при гипертиреозе, гипотрофии и т.д.

Лабораторная работа 7. Определение содержания холестерола в сыворотке крови методом Илька

Биохимические исследования содержания в крови холестерина и его эфиров имеют важное диагностическое значение. Наиболее распространенным заболеванием, связанным с нарушениями обмена холестерина, является атеросклероз. При атеросклерозе содержание холестерина в сыворотке крови увеличивается и происходит его отложение в стенках артерий.

Принцип метода.Холестерин в присутствии уксусного ангидрида и смеси концентрированных серной и уксусной кислот дает изумрудно-зеленое окрашивание (цветная реакция Либермана-Бурхард), интенсивность которого пропорциональна содержанию холестерина в пробе.

Материалы и реактивы:

1. Цветной реактив Либермана-Бурхард (представляет собой смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрирован­ной серной кислоты в соотношении 1:5:1 по объему).

2. Стандартный раствор холестерина (2 г/л) в этиловом спирте

Ход работы.

Анализ опытной пробы. В сухую пробирку налить 2,0 мл цветного реактива, медленно и осторожно добавить по 0,1 мл негемолизированной сыворотки так, чтобы раствор стек по стенке пробирки. Пробирку энергично встрях­нуть 10-12 раз. Термостатировать 20 мин в темноте при +37^оС. Колориметрировать против реактива Либермана-Бурхард при красном светофильтре (630-690 им) и длине оптического пути 0,5 см. Количество холестерина в пробе (0,1 мл) определить с помощью калибровочно­го графика и выразить в г/л.

Построение калибровочного графика. Приготовить 5 пробирок с разведением стандартного раствора холестерина согласно таблице.

	Пробирка
	1	2	3	4	5
Стандартный р-р холестерина, мл	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
Реактив Либермана-Бурхард, мл	0,8	0,6	0,4	0,2	–
Количество холестерина в пробе, мг	40	80	120	160	200

В 5 сухих пробирок налить по 2 мл цветного реактива и по 0,1 мл калибровочного раствора из каждой пробы (по таблице) соответственно. Обработать пробы аналогично опытной. Построить калибровочный график.

Клинико-диагностическое значение. Нормальное содержание холестерола в крови человека составляет 1,5–2,5 г/л. Увеличение содержания холестерола в крови – наиболее достоверный фактор риска развития коронарного атеросклероза, ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда. Наиболее высокий уровень холестерина зафиксирован при генетических нарушениях в обмене липопротеинов. Вторичная гиперхолестеринемия наблюдается при заболеваниях печени, заболеваниях почек (гломерулонефрите, нефротическом синдроме с отёками, хронической почечной недостаточности), злокачественной опухоли поджелудочной железы, гипертонической болезни, эндокринных заболеваниях. Очень высокое содержание холестерина в крови (в 5 раз выше нормального) отмечено при сахарном диабете и липоидном нефрозе.

В ка­честве веществ гипохолестеринемического действия применя­ются некоторые ингибиторы биосинтеза холестерина.

Гипохолестеринемия наблюдают в период голодания, при гипотиреозе, острых инфекционных заболеваниях, пневмонии, бронхите, анемии, гемолитической желтухе, злокачественных опухолях печени, остром гепатите и др.

Лабораторная работа 8. Качественная проба на кетоновые тела

Кетоновые тела (ацетоацетат, -гидроксибутират и ацетон) синтезируются в митохондриях печени из ацетил-КоА, который образуется при окислении жирных кислот. В условиях снижения утилизации глюкозы тканями (голодание, сахарный диабет, резкие смены диеты и др.) синтез кетоновых тел значительно усиливается, кетоновые тела поступают из печени в кровь и используются как источники энергии в других органах и тканях. При некомпенсированном са­харном диабете концентрация ацетоновых тел в крови и уровень их выделения с мочой могут увеличиваться в сотни раз (кетонемия и кетонурия, соответственно).

Ход работы. В пробирку поместить 2-3 мл мочи, содержащей кетоновые тела, прибавить несколько капель свежеприготовленного раствора нитропруссида Na, затем несколько капель 10%-ного раствора NaOH и 0,5 мл ледяной уксусной кислоты. Жидкость окрашивается в вишнево-красный цвет, что указывает на присутствие ацетоуксусной кислоты и ацетона.

Клинико-диагностическое значение. Содержание кетоновых тел в плазме крови здорового человека очень невелико — до 10 мг/л. С мочой в сутки выделяется 20-40 мг кетоновых тел. Увеличение количества кетоновых тел в крови (кетонемия) и моче (кетонурия) наблюдается при сахарном диабете, дефиците углеводов в питании (углеводное голодание), тиреотоксикозе, поражении печени, тяжелых интоксикациях.

Лабораторная работа 9. Фурфуроловая проба на жёлчные кислоты

Желчные кислоты являются производными холестерина и участвуют в эмульгировании липидов пищи. Реакция обусловлена образованием окрашенных в красный цвет продуктов конденсации жёлчных кислот с оксиметилфурфуролом. Оксиметилфурфурол образуется при взаимодействии сахарозы с концентрированной серной кислотой.

Ход работы. К 10 каплям разведенной в 3 раза желчи добавить 1 каплю 5% раствора сахарозы и осторожно по стенке подслоить 1 мл концент­ри­ро­ван­ной серной кислоты. На границе раздела 2-х жидкостей появляется окрашенный в красноватый цвет продукт конденсации желчных кислот с образовавшимся из сахарозы оксиметилфурфуролом.

Клинико-диагностическое значение. При механической желтухе вследствие закупорки общего желчного протока камнем или опухолью желчные капилляры переполняются желчью, и желчь проникает в кровь. В этом случае происходит усиленное выделение желчных пигментов (билирубин, биливердин) и желчных кислот с мочой.

Контрольные вопросы по теме ”Метаболизм липидов и его регуляция”:

1. Катаболизм триацилглицеролов в адипоцитах жировой ткани: последовательность реакций, механизмы регуляции активности триацилглицероллипазы.

2. Нейрогуморальная регуляция липолиза с участием адреналина, норадреналина, глюкагона и инсулина.

3. Реакции окисления жирных кислот (β-окислние); роль карнитина в транспорте жирных кислот в митохондрии.

4. Энергетический баланс β-окисления жирных кислот в клетках.

5. Окисление глицерола: ферментативные реакции, биоэнергетика.

6. Кетоновые тела. Реакции биосинтеза и утилизации кетоновых тел, физиологическое значение.

7. Нарушение обмена кетоновых тел при патологиях (сахарный диабет, голодание).

8. Биосинтез высших жирных кислот: реакции биосинтеза высших жирных кислот (пальмитата) и регуляция процесса.

9. Биосинтез моно- и полиненасыщенных жирных кислот в организме человека.

10. Биосинтез триацилглицеролов и фосфолипидов.

11. Метаболизм сфинголипидов. Генетические аномалии обмена сфинголипидов – сфинголипидозы.

12. Биосинтез холестерола: схема реакций, регуляция синтеза холестерола.

13. Пути биотрансформации холестерола: этерификация, образование жёлчных кислот, стероидных гормонов, витамина D₃.

14. Циркуляторный транспорт и депонирование липидов в жировой ткани. Липопротеинлипаза эндотелия.

15. Липопротеины плазмы крови: липидный и белковый состав. Гиперлипопротеинемии.

16. Патологии липидного обмела: атеросклероз, ожирение, сахарный диабет.