Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
МЕТОДИЧКА ФФМ.doc
Скачиваний:
202
Добавлен:
13.03.2016
Размер:
991.74 Кб
Скачать

Тема 2. Ферменты и коферменты

Ферментами называются белки, обладающие каталитическими свойствами. Согласно современной классификации ферменты делят на 6 классов в соответствии с типом катализи­руемой ими реакции.

Класс

Какие реакции катализируют

Представители

1

Оксидо­редуктазы

Окислительно-восстановительные реакции

Лактатдегидрогеназа, каталаза, гидроксилазы

2

Трансферазы

Межмолекулярный перенос различных химических групп

Аминотрансферазы, трансметилаза

3

Гидролазы

Гидролиз

Трипсин, уреаза, -глюкозидаза, амилаза

4

Лиазы

Расщепление с образованием двойных связей или присо­единение по двойным связям

Альдолаза, карбоангидраза

5

Изомеразы

Изомеризация

Рацемазы, эпимеразы, мутазы

6

Лигазы

Образование связей С-С, С-O, C-N и др. с затратой энергии

ДНК-полимераза, аминоацил-тРНК-синтетаза

Внутри каждого класса существует деление на под­классы и подподклассы, которые уточняют природу ферментативной реакции.

Ферменты могут быть простыми и сложными белками. Ферменты, которые являются сложными белками, имеют в своем составе белковую часть, которую называют апоферментом, и небелковый компонент (кофермент или простетическая группа). Ферментативное действие оказывает только фермент в целом (холофермент); ни кофермент, ни апофермент в отдельности не активны. Многие коферменты являются производными витаминов и входят в так называемый «активный центр» фермента, который определяет каталитическую активность фермента. К основным свойствам ферментов как биологических катализаторов относят их высокую активность, специфичность, термолабильность, зависимость активности ферментов от рН среды и регулируемость (изменение активности ферментов в присутствии активаторов и ингибиторов или за счет ковалентных модификаций). Данные свойства обусловлены белковой природой ферментов.

Лабораторная работа 5. Свойства ферментов

Свойства ферментов удобно изучать на примере амилазы слюны. Амилаза (-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1) осуществляет гидролиз крахмала или гликогена через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы. Мальтоза далее под влиянием фермента мальтазы слюны расщепляется на две молекулы глюкозы.

Следить за ходом гидролиза можно с помощью окрашивания реакционной смеси реактивом Люголя (раствор йода в водном йодистом калии). Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают разную окраску йодом. амило-декстрины – сине-фиолетовое, эритродекстрины – красное окрашивание, ахродекстрины и мальтоза окрашивания с йодом не дают (желтоватая окраска обусловлена цветом самого реактива Люголя). Конечными продуктами гидролиза крахмала под действием -амилазы являются низкомолекулярные декстрины и мальтоза. Об их присутствии судят по реакции Фелинга.

Фракция продуктов гидролиза крахмала

Окраска раствора при добавлении раствора Люголя

Крахмал

Синий, мутный

Амилодекстрины

Сине-фиолетовый, прозрачный

Эритродекстрины

Красный

Ахродекстрины и мальтоза

Бледно-желтый

В качестве источника амилазы в работах 1-3 использовать слюну, разведенную в 4-5 раз.

Работа 1. Влияние температуры на активность ферментов

Скорость ферментативных реакций, как и любых других химических реакций, зависит от температуры: при повышении температуры на 10оС скорость увеличивается приблизительно в 2 раза. Однако для ферментативной реакции это правило выполняется только в области низких температур – до 50-60 оС. При более высоких температурах происходит денатурация фермента, а следовательно, он терцет каталитическую активность.

Ход работы. В 3 пробирки (№1-3) внести по 2 мл 0,5%-ного раст­вора крахмала (субстрат). В другие 3 пробирки (№4-6) внести по 10 капель разведенной слюны (источник фермента). В течение 5 мин пробирки №1 и №4 инкубировать во льду, пробирки №2 и №5 – в термостате при 370С, а пробирки №3 и №6 – в кипящей водяной бане. Затем содержимое пробирок 1 и 4, 2 и 5, 3 и 6 слить вместе (пробирки с субстратом и источником фермента), тщательно перемешать и оставить при тех же температурных условиях на 10-15 мин. Далее при комнатной температуре добавить 3-5 ка­пель реактива Люголя, сравнить окраску и занести результаты в таблицу:

Пробирки

№1 и №4

№2 и №5

№3 и №6

Температура

0 оС

37 оС

100 оС

Окраска с реактивом Люголя

Сделать вывод об оптимальной температуре для работы амилазы.

Работа 2. Влияние рН среды на активность ферментов

Каждый фермент проявляют максимальную активность при определенном значении рН. Это значение называется оптимальным рН. Оптимум рН для большинства ферментов лежит в пределах от 6 до 8, однако есть ферменты с оптимумами рН гораздо ниже 6 (пепсин, рНопт=1,9) и выше 8 (аргиназа, рНопт=9,7). Ниже и выше оптимального значения рН наблюдается снижение активности ферментов. В определённом диапазоне рН процесс обратим. Зависимость активности фермента от рН обусловлена влиянием изменения концентрации ионов водорода на степень ионизации ионогенных групп фермента и субстрата. При экстремальных значениях рН происходит кислотная или щелочная денатурация фермента, следовательно он необратимо теряет активность.

Ход работы. В 4 пробирки налить по 1 мл буферных растворов с различными значениями рН (согласно таблице).

№ пробирки

рН буферного

раствора

Окраска при добавлении

Реактива Люголя

1

5,0

2

6,9

3

7,5

4

8,2

В каждую пробирку добавить по 5 капель 0,5% раствора крахмала и по одной капле разведенной слюны. Перемешать, поместить в термостат (+37°) на 6-7 мин. затем пробирки вынуть из термостата и в каждую добавить по капле реактива Люголя. Сравнить окраску растворов. Результаты занести в таблицу. Сделать вывод о том, при каком значении рН гидролиз крахмала амилазой идет с наибольшей скоростью.

Работа 3. Специфичность действия ферментов

Специфичность действия является одним из важнейших свойств ферментов и заключается в том, что каждый фермент катализирует превращение одного субстрата или группы близких субстратов и одного вида или группы близких химических связей. Специфичность ферментов может быть абсолютной и относительной. Ферменты с абсолютной специфичностью (уреаза, сукцинатдегидрогеназа) катализируют превращение только одного субстрата, а с относительной специфичностью (фосфатазы, протеиназы) – однотипные превращения сходных по строению веществ.

Амилаза расщепляет полисахариды и не действует на дисахариды (мальтозу, лактозу или сахарозу).

Ход работы. В одну пробирку налить 1 мл 0,5% раствора крахмала, а в другую - 1 мл 0,5% раствора сахарозы. В обе пробирки внести по 5 капель разведенной слюны (источник амилазы). Содержимое пробирок перемешать и поместить на 15 мин в термостат (+37°С). Затем в обеих пробирках проводят реакцию Фелинга (добавить равный объем реактива Фелинга и нагреть). Отметить, в какой из пробирок реакция Фелинга положительна. На основании этих результатов делают вывод о характере действия амилазы на данные субстраты.

Лабораторная работа 6. Действие некоторых ферментов (уреаза)

Уреаза (карбамидамидогидролаза, КФ 3.5.1.5) принадлежит к ферментам класса гидролаз, группы амидаз и расщепляет мочевину до двух молекул аммиака и углекислого газа.

Вводе СО2 превращается в Н2СО3 (слабая кислота), а NH3 – в (NH4)OH (сильное основание), в связи с чем изменяется рН среды.

По своему действию уреаза строго специфична — она расщепляет только мочевину, не оказывая влияния на ее производные. Уреаза встречается у очень большого числа растений, плесневых грибов и бактерий. Особенно велико содержание уреазы в бобах сои. У человека она найдена в желудке, где частично нейтрализует HCl желудочного сока за счёт образования (NH4)OH.

Ход работы. В пробирку налить 2 мл 2% раствора мочевины и добавить около 0,5 г соевой муки, перемешать и добавить 2-3 капли раствора фенол­фталеина. В контрольную пробу налить то же количество раствора мочевины и фенолфталеина, но не добавлять соевую муку. Обе пробы оставить при комнатной температуре и проследить за изменением окраски индикатора. Дать пояснения.

Лабораторная работа 7. Количественное определение активности амилазы по Вольгемуту

О наличии фермента в исследуемом гомогенате или экстракте ткани судят либо по снижению концентрации субстрата, на который действует фермент, либо по накоплению продукта реакции. Так, о присутствии амилазы в слюне можно судить по исчезновению крахмала, добавленного к слюне (проба с йодом), или по накоплению глюкозы (проба Фелинга).

Количество фермента можно оценить, измерив величину каталитической активности этого фермента, т.е. скорость реакции, катализируемой этим ферментом. Причем измеряют начальную скорость реакции, когда она линейно зависит от концентрации фермента. Определение активности ферментов проводят в буферных растворах, имеющих значение рН, близкое к оптимальному для данного фермента, при температуре 25—38°С и при концентрации субстрата, близкой к насыщающей. В состав опытных смесей добавляют необходимые коферменты, активаторы и стабилизаторы; последние предотвращают денатурацию ферментного белка.

Согласно международному соглашению за единицу активности U (1U) фермента принимается такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин при 30 °С в оптимальных условиях (рН, концентрация субстрата, кофакторов и др.). Молекулярной активностью называется число молекул субстрата, которое подвергается превращению одной молекулой фермента за 1 мин. Удельная активность выражается числом единиц активности фермента в рассчёте на 1 мг белка (U/мг белка). Другой международной единицей активности фермента является катал (кат) – количество фермента, которое катализирует превращение 1 моль субстрата в секунду. Употребляются также (особенно в медицине) некоторые тривиальные способы выражения активности ферментов.

Метод опредеделения активности амилазы слюны основан на выявлении предельного разбавления раствора амилазы, при котором в стандартных условиях еще происходит расщепление определенного количества 0,1% раствора крахмала до эритродекстрина. Амилазная активность слюны выражается в количестве (в мл) 0,1% раствора крахмала, которое гидролизуется 1 мл неразбавленной слюны при +38° за 30 мин. В норме амилазная активность слюны А(38о/30) = 160-320 ед.

Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности в крови и моче.

Материалы и реактивы: 2 мл раствора слюны, разбавленной в 4 раза (к 0,5 мл слюны добавить 1,5 мл дистиллированной воды); 0,1 % рас­твор крахмала; реактив Люголя (0,1 % раствор иода в 0,2 % растворе иодида калия).

Ход работы. В семь пронумерованных пробирок внести из бюретки по 1мл дистиллированной воды. В 1-ю пробирку добавить 1 мл разбав­ленной в 4 раза слюны. Содержимое хорошо перемешать и 1 мл полученного раствора перенести из первой пробирки во вторую, из нее — таким же образом в третью и т. д. Из 7-й пробирки 1 мл жидкости вылить. Таким образом, в каж­дой последующей пробирке содержание фермента в 2 раза меньше, чем в предыдущей (разбавление возрастает вдвое). Далее во все пробирки прилить по 2мл 0,1 % раствора крахмала, перемешать и поместить пробирки в термостат (+37°С) на 30 мин. После этого пробирки охладить под проточной водой для пре­кращения действия фермента. В каждую пробирку добавить по 2-3 капли раствора Люголя, хорошо перемешать и пронаблюдать за изменением окраски. Жидкость в пробирках может окрашиваться в желтый, красный и синий цвета. Желтый цвет свидетельствует о полном расщеплении крахмала. Результаты наблюдений заносят в таблицу.

Показатель

Пробирка

№1

№2

№3

№4

№5

№6

№7

Разбавление слюны (или мочи)

8

16

32

64

128

256

532

Окраска с реактивом Люголя

Устанавливают минимальное количество слюны, способное рас­щепить 2 мл крахмала, и рассчитывают количество крахмала, которое расщепляется амилазой, содержащейся в 1 мл слюны. Для этого отмечают пробирку с раствором красноватого оттенка и производят расчет амилазной активности.Пример расчета: В 1,2,3 и 4-й наблюдается слабо-желтое окрашивание, в 5-й пробирке – красно-оранжевое или красно-фиолетовое, в 6-й и 7-й – синее. Для расчета берем пробирку №5, в которой слюна разбавлена в 128 раз. В ней содержится минимальное количество слюны (1/128 мл), способное расщепить 2 мл 0,1% крахмала. Тогда 1 мл слюны расщепляет Х мл 0,1% раствора крахмала. Х=12128 = 256 ед.

Контрольные вопросы по теме ”Ферменты и коферменты”:

  1. Ферменты: определение, свойства ферментов как биологических катализаторов.

  2. Классификация и номенклатура ферментов, характеристика отдельных классов ферментов.

  3. Строение и механизмы действия ферментов. Активный и аллостерический (регуляторный) центры.

  4. Кофакторы и коферменты. Строение и свойства коферментов, витамины как предшественники в биосинтезе коферментов.

  5. Коферменты: типы реакций, которые катализируют отдельные классы коферментов.

  6. Изоферменты, особенности строения и функционирования, значение в диагностике заболеваний.

  7. Механизмы действия и кинетика ферментативных реакций: зависимость скорости реакции от концентрации субстрата, рН и температуры.

  8. Принципы и методы выявления ферментов в биообъектах. Единицы измерения активности и количества ферментов.

  9. Активаторы и ингибиторы ферментов: примеры и механизмы действия.

  10. Типы ингибирования ферментов: обратимое (конкурентное, неконкурентное) и необратимое ингибирование.

  11. Регуляция ферментативных процессов. Пути и механизмы регуляции: аллостерические ферменты; ковалентная модификация ферментов.

  12. Циклические нуклеотиды (цАМФ, цГМФ) как регуляторы ферментативных реакций и биологических функций клетки.

  13. Энзимопатии – врожденные (наследственные) нарушения метаболизма углеводов, аминокислот, порфиринов, пуринов.

  14. Энзимодиагностика заболеваний.

  15. Энзимотерапия – применение ферментов, их активаторов и ингибиторов в лечебных целях.