Работа 1. Реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина

В 3 пробирки вности по 3 капли препарата инсулина и про­вести реакции: биуретовую, Миллона и Фоля.

Работа 2. Качественная реакция на тироксин

Тироксин можно обнаружить в препарате тиреоидина, получаемого из щитовидной железы крупного рогатого скота. Обнаруживают тироксин следующим образом – отщепляют от него с помощью кислотного гидролиза йодоводородную кислоту и переводят ее в свободный йод. Последний экстрагируют хлороформом, который окрашивается при этом в фиолетовый цвет.

Ход работ. В пробирку внести полтаблетки тиреоидина и 10 капель НNO₃. Осторожно нагреть 1-2 мин. Затем добавить 20 капель 1% KIO₃ (иодат калия), перемешать и охлаждить. KIO₃ окисляет освободившуюся при гидролизе йодоводородную кислоту в свободный иод.

5НCI + KIO₃ + HNO₃ = 3I₂ + KNO₃

В пробирку добавить 1-2 мл хлороформа и хорошо встряхнуть. После отстаивания слой хлороформа (нижний) окрашивается в фиолетовый цвет.

Работа 3. Качественные реакции на адреналин

Раствор адреналина: (содержимое ампулы 0,1%) растворить в 100 мл воды.

Адреналин образуется из тирозина при участии метионина (донор метильной группа). При образовании адреналина кольцо тирозина превращается в пирокатехиновое кольцо (оно легко окисляется, об­разуя различные цветные соединения). Это и используется во мно­гих цветных реакциях на адреналин.

1) Диазореакция. Ход работы. В пробирку поместить 3 капли 1% раствора сульфаниловой кис­лоты, 3 капли 5% раствора азотистокислого Na, 5 капель раство­ра адреналина (1:1000) и 3 капли 10% раствора углекислого Na. Жидкость окрашивается в красный цвет.

2) Реакция с йодатом калия. Ход работы. В пробирку внести 3 капли адреналина (1:1000), 2-3 капли 10% раствора KIO₃ и 2 капли 10% CH₃COOH. Жидкость слегка нагре­ть. Появляется красно-фиолетовое окрашивание.

Результаты исследования гормонов оформить в виде таблицы:

Железа внутренней секреции	Гормон	Химическое строение	Метаболи­ческая роль	Употребля­емые реактивы	Получае­мое окра­шивание

Определение концентрацииадреналина

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении интенсивности синего окра­шивания, которое образуется при взаимодействии адреналина с реак­тивом Фолина. Реактив Фолина состоит из солей фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот. Эти соли при взаимодействии с фенолами восстанавливаются с образованием более низких окислов, комплексы которых окрашены в синий цвет.

Ход работы.

В сухую пробирку внести1 мл исследуемого раствора, 4 мл 10% раствора Na₂CO₃ и 0,5 мл реактива Фолина. Содержимое встряхнуть. Через 3-5 мин появляется синяя окраска. Экстинкцию изме­рить на ФЭК против контроля (контроль – 1 мл Н₂О, 4 мл 10% Na₂CO₃ и 0,5 мл реактива Фолина). Количество адреналина определить по калибровочной.

Калибровочная для определения адреналина

В мерную колбу емкостью 25 мл вносят точно 1 мл коммерческого адреналина. Доводят до метки водой. 1 мл стандартного раствора содержит 0,04 мг адреналина, что соответствует концентрации 4 мг%. Этот раствор разводят следующим образом:

Номера пробирок	Контроль	1	2	3	4
Стандартный раствор адреналина (мл)	0	1	0.75	0,5	0,25
H2O (мл)	1	0	0,25	0,5	0,75
Концентрация адреналина (г/л)	0	0,04	0,03	0,02	0,01
Оптическая плотность раствора (Е)

Лабораторная работа 4. Количественное определение общего кальция в биологических жидкостях

Функции кальция в организме разнообразны и обеспечиваются особенностями его распределения и химическими свойствами ионов, в частности способностью специфично и крепко связываться с белками. Соли кальция обеспечивают жёсткую структуру костей и зубов. Органической основой кости, на которую откладываются соли кальция, является коллаген. Кристаллы солей кальция в кости связаны с поверхностью коллагеновых нитей. Ионы минерального компонента костей постоянно обмениваются путём диффузии с ионами межклеточной жидкости и плазмы крови, благодаря чему костная ткань служит депо минеральных солей организма, особенно кальция.

Ионы кальция играют роль вторичного посредника в реализации ответа клеток на внешние сигналы (нервные, гормональные и т.д.). При действии сигналов открываются кальциевые каналы, и содержание ионов кальция в цитоплазме возрастает в тысячи раз. Ионы связываются со специфическими внутриклеточными белками, запускают цепь реакций, что приводит к физиологическому ответу клетки. Такими Са²⁺-связывающими белками являются тропонин С (регуляция сокращения скелетных мышц и миокарда), легкая цепь миозина (регуляция сокращения гладкой мускулатуры), витамин D-зависимый белок (регуляция всасывания кальция в кишечнике), белок S-100 нервной ткани (регуляция фосфорилирования белков), кальмодуллин (образование комплекса с ионами кальция, который активирует многие ферментов). С прекращением действия внешнего сигнала Са²⁺-АТФазы выкачивают ионы кальция из цитоплазмы, активный комплекс диссоциирует и активность ферментов снижается. Ионы кальция принимают участие в процессе свёртывания крови. Ионы кальция влияют на порог возбудимости нервных клеток.

Концентрацию ионов кальция в плазме крови регулируют паратгормон и кальцитонин, а также витамин D. Паратгормон стимулирует процесс резорбции костной ткани и выхода кальция и фосфатов в кровь, а кальцитонин тормозит этот процесс. Синергистом паратгормона в действии на костную ткань является производное витамина D 1,25-диоксихолекальциферол. В почках паратгормон стимулирует реабсорбцию Са²⁺ дистальными канальцами. Таким образом, эффективность регуляции гомеостаза Са²⁺ зависит от функционирования паращитовидных и щитовидной желёз, почек, кишечника и поступления в организм кальция и витамина D.

Принцип метода: ионы кальция в щелочной среде вступают в реакцию с окрезолфталеин-комплексоном, образуя окрашенный комплекс. Интенсивность фиолетовой окраски образующегося комплекса пропорциональна концентрации кальция в анализируемой пробе.

Материалы и реактивы:

1.Хромоген:

-крезолфталеин комплексон (0,120,01) мМ

-оксихинолин (16,0-0,16)мМ

соляная кислота (60,06,00) мМ

2.Буфер: моноэтаноламин (0,80,08) мМ

3.Калибровочный раствор кальция (2,50,05) мМ или 0,1 г/л

Ход работы:

Анализ проводится в соответствии со схемой, представленной в таблице

Отмерить в кювету, мл	Холостая проба	Калибровочная проба	Опытная проба
Хромоген	2,50	2,50	2,50
Образец	-	-	0,15
Калибровочный раствор	-	0,05	-
Буфер	2,50	2,50	2,50
Н2О дист.	0,05	-	-
Смешать и выдержать (101) мин при комнатной температуре (от +20 до +250С). Оптическую плотность опытной (Еопыт.) и калибровочной пробы (Екалибр.) измерить против холостой не позднее (305) мин при 550-590 нм в кювете с длиной оптического пути 5 или 10 мм.

Расчет результатов:

Кальций (мМ) = 2,5  Е_опыт / Е_{калибр.}

или

Кальций (г/л) = 0,1  Е_опыт / Е_{калибр.}

Для расчета концентрации кальция в суточной моче полученное выше значение (мМ) умножают на объем суточной мочи, выраженный в л (получают ммоль/сут.), или значение (г/л) умножают на объем суточной мочи, выраженный в л, и коэффициент 10 (получают г/сут.).

Нормальные величины содержания кальция:

Сыворотка	г/л	мМ
- 9-10 дней	0,076-0,104	1,90-2,60
- 10 дней – 24 месяца	0,090-0,110	2,25-2,75
- 24 месяца – 12 лет	0,088-0,108	2,20-2,70
- 12-18 лет	0,040-0,102	2,10-2,55
- 18-60 лет	0,086-10,0	2,15-2,50
- 60-90 лет	0,088-0,102	2,20-2,55
- старше 90 лет	0,082-0,096	2,05-2,40
Моча, суточная норма	г/сут.	ммоль/сут.
- Отсутствие Са в диете	0,005-0,04	0,13-1,00
- Потребление Са ниже среднего уровня	0,05-1,5	1,25-3,75
- Средний уровень потребления Са	0,1-0,3	2,50-7,50

Средний уровень потребления Са – 0,800 г/сут. (20 ммоль/сут.)

Лабораторная работа 5. Количественное определение содержания неорганического фосфора в биологических жидкостях

В организме человека содержатся органические и неорганические фосфаты. 85% фосфатов содержится в костях. Фосфорные группы есть в фосфопротеинах, нуклеиновых кислотах, фосфолипидах, нуклеотидных коферментах. Важное биологическое значение имеют макроэргические фосфаты – АТФ, АДФ, креатинфосфат. Моно- и дигидрофосфаты калия или натрия образуют фосфатную буферную систему. Регуляция обмена фосфатов осуществляется вместе с кальцием. Усиливая остеолиз, паратгормон увеличивает содержание фосфатов в крови. Кальцитонин тормозит процесс остеолиза. В почках паратгормон снижает реабсорбцию фосфатов.

Принцип метода: неорганический фосфат образует с молибденовой кислотой, в сильно кислой среде фосфомолибденовую кислоту, восстанавливающуюся в присутствии железа (ІІ) в молибденовую синь. Осаждаемые индикаторным реагентом белки растворяются при добавлении стабилизатора – триэтаноламина. Оптическая плотность реакционного раствора пропорциональна концентрации неорганического фосфора в пробе.

Материалы и реактивы:

1. Индикаторный реагент:

- молибдат аммония (402) мМ

- серная кислота (50,25) М

- стабилизаторы, активаторы.

2.Раствор стабилизатора: триэтаноламин (3,420,17) М

3.Калибровочный раствор фосфора (1,6150,08) мМ или 50 мкг/л

Ход работы:

Анализ проводится в соответствии со схемой, приведенной в таблице.

Отмерить в кювету, мл	Опытная проба	Калибр. проба	Холостая проба
Образец	0,10	-	-
Калибровочный раствор	-	0,10	-
Дистиллированная вода	-	-	0,10
Индикаторный реагент	2,00	2,00	2,00
Перемешать, выдержать 5-6 мин. при комнатной температуре (от + 20 0С до +25 0С) и измерить оптическую плотность опытной пробы (Еопыт.), и калибровочной пробы (Екалиб.) против холостой пробы (окраска устойчивая в течение 30 мин) при длине волны 570-660 нм в кюветах толщиной 10 мм. Если после добавления раствора стабилизатора раствор не очистился – необходимо добавить в каждую пробирку по одной капле 1 М NaOH.

Расчет концентрации фосфора :

,где

где 1,615(50) – концентрация фосфора в калибровочном растворе, мМ (мкг/л);

Е_опыт. – оптическая плотность исследуемой пробы, ед. опт. плотности;

Е_калиб. – оптическая плотность калибровочной пробы, ед. опт. плотности;

С – концентрация фосфора в исследуемой пробе, мМ (мкг/л).

Полученную концентрацию фосфора в моче необходимо умножить на коэффициент разведения – 20.

Нормальное содержание фосфора:

Сыворотка	мМ	мкг/л
Взрослые 12-60 лет	0,87-1,45	27-45
Мужчины старше 60 лет	0,74-1,20	23-37
Женщины старше 60 лет	0,90-1,32	28-41
Новорожденные	1,45-2,91	45-90
Ребенок	1,45-2,16	45-67
Дети	1,45-1,78	4,5-5,5
Моча	29-48 ммоль/сут.	0,9-1,5 г/сут.

Контрольные вопросы по теме ”Молекулярные механизмы действия гормонов на клетки-мишени”:

1. Гормоны: общая характеристика; роль гормонов и других биорегуляторов в системе межклеточной интеграции функций организма человека.

2. Классификация гормонов и биорегуляторов: соответствие структуры и механизмов действия гормонов.

3. Реакция клеток-мишеней на действие гормонов. Мембранные (ионотропные, метаботропные) и цитозольные рецепторы.

4. Биохимические системы внутриклеточной передачи гормональных сигналов: G-белки, вторичные посредники (цАМФ, Са²⁺, кальмодулин, ИФ₃, ДАГ).

5. Молекулярно-клеточные механизмы действия стероидных и тиреоидных гормонов.

Контрольные вопросы по теме ”Биохимия гормональной регуляции метаболизма”:

1. Гормоны гипоталамуса – либерины и статины.

2. Гормоны передней части гипофиза: соматотропин (СТГ), пролактин, патологические процессы, связанные с нарушением функции этих гормонов.

3. Гормоны задней части гипофиза. Вазопрессин и окситоцин: строение, биологические функции.

4. Инсулин: строение, биосинтез и секреция; влияние на обмен углеводов, липидов, аминокислот и белков. Ростстимулирующие эффекты инсулина.

5. Глюкагон: регуляция обмена углеводов и липидов.

6. Тиреоидные гормоны: структура, биологические эффекты Т₄ и Т₃. Нарушение метаболических процессов при гипо- и гипертиреозе.

7. Катехоламины (адреналин, норадреналин, дофамин): строение, биосинтез, физиологические эффекты, биохимические механизмы действия.

8. Стероидные гормоны коры надпочечников (С₂₁-стероиды) – глюкокортикоиды и минералокортикоиды; строение, свойства.

9. Женские половые гормоны: эстрогены, прогестерон. Физиологические и биохимические эффекты, связь с фазами овуляционного цикла.

10. Мужские половые гормоны (С₁₉-стероиды). Физиологические и биохимические эффекты андрогенов; регуляция синтеза и секреции.

11. Гормональная регуляция гомеостаза кальция в организме. Паратгормон, кальцитонин, кальцитриол.

12. Эйкозаноиды: строение, биологические и фармакологические свойства. Аспирин и другие нестероидные противовоспалительные средства как ингибиторы синтеза простагландинов.

МОДУЛЬ 4. БИОХИМИЯ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ