Тема 3. Метаболизм аминокислот. Энзимопатии аминокислотного обмена

В живых организмах постоянно происходит интенсивное обновление белковых молекул. Образующиеся при гидролизе эндогенных белков аминокислоты могут использоваться для биосинтеза новых белков или для синтеза биологически важных азотсодержащих соединений (пуриновых и пиримидиновых оснований, некоторых гормонов и др.).

Белковый обмен в организме человека и животных в значительной мере зависит от поступления с пищей достаточного количества белков, содержащих полный набор незаменимых аминокислот (полноценные белки). Для человека незаменимыми аминокислотами являются лизин, аргинин, гистидин, валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, фенилаланин, триптофан. К полноценным белкам относят казеин молока, альбумин яйца, белки рыбы и мяса, к неполноценным (отсутствуют незаменимые аминокислоты) – многие растительные белки.

Белки пищи, поступая в организм, подвергаются в пищеварительном тракте гидролитическому расщеплению до аминокислот, которые в результате всасывания в тонком кишечнике поступают в кровь воротной вены, и далее в печень, где включаются в тканевой обмен. Часть аминокислот из печени поступает в систему кровообращения и утилизируется тканями, а часть дезаминируется и превращается или в ацетил-КоА (кетогенные аминокислоты), или в метаболиты цикла Кребса и пируват (гликогенные).

В тканях аминокислоты используются для синтеза белков или подвергаются дезаминированию, трансаминированию, декарбоксилированию, метилированию, в зависимости от того, используются они для синтеза специализированных биологически активных соединений (см. таблицу) или участвуют в энергетическом обмене.

Аминокислота	Производные
Суммарно	Белки, полипептиды, гормоны пептидной природы, нейромедиаторы и др.
Тирозин	Катехоламины, тироксин
Триптофан	Серотонин
Гистидин	Гистамин
Глутамат	-Аминомасляная кислота
Глицин, аргинин, метионин	Креатин
Метионин, серин	Холин
Глицин	Порфирины
Глицин, аспартат	Нуклеотиды
Глицин, аланин, серин, триптофан, валин, аспарагиновая, глутамат и др.	Углеводы
Фенилаланин, тирозин, лейцин, лизин, триптофан и др.	Липиды
Орнитин, цитруллин, аргинин, аспартат	Мочевина

Катаболизм большинства аминокислот начинается с реакций трансаминирования (обратимый перенос аминогруппы от -аминокислоты на -кетокислоту), катализируемых аминотрансферазами. Катаболизм большинства аминокислот начинается с реакций трансаминирования (обратимый перенос аминогруппы от -аминокислоты на -кетокислоту), катализируемых аминотрансферазами.

Аминогруппы различных аминокислот при трансаминировании переносятся, в основном, на -кетоглутаровую кислоту с образованием глутаминовой кислоты, которая далее может подвергаться окислительному дезаминированию до иминокислоты, а затем гидролитически расщепляется на кетокислоту (-кетоглутаровая кислота) и аммиак. Эта реакция катализируется глутаматдегидрогеназой. Высвобождающийся аммиак используется для восстановительного аминирования кетокислот, синтеза пиримидиновых нуклеотидов и некоторых других веществ. При накоплении аммиак весьма ток­сичен и в организме имеется ряд механизмов, обезвреживающих аммиак. В печени осуществляется основной механизм обезвреживания аммиака — синтез мочевины, которая является главным конечным продуктом белкового обмена в организме человека и значительно менее токсична, чем другие азотсодержащие продукты обмена. Дополнительным механизмом является связывание аммиака глутаминовой и аспарагиновой кислотами с образованием амидов (глутамина и аспарагина). Глутамин представляет собой транспортную форму аммиака у животных. В виде глутамина аммиак транспортируется в печень и почки.

Исследование содержания небелкового азота сыворотки крови и мочи, а также соотношения белкового и небелкового азота в крови позволяют судить об обмене белков в организме и отдельных тканях, о балансе процессов биосинтеза и деградации белка. Основной вклад в небелковый азот крови вносят мочевина (50-60%), а также свободные аминокислоты и нуклеотиды, креатин, билирубин, мочевая кислота. В общий азот мочи включают сумму всех азотсодержащих веществ: мочевина (80-90 %), аммонийные соли (4-6 %), креатинин (2-7 %), а также индикан, гиппуровая кислота, глюкуроновые кислоты, мочевая кислота и свободные аминокислоты.

Лабораторная работа 10. Определение активности аминотрансфераз

Активность аминотрансфераз (прежде всего аланин- и аспартатаминотрансферазы – АлАТ и АсАТ, соответственно) рассматривается как один из важных показателей обмена белков и аминокислот.

Принцип метода: вследствие аминирования α-кетоглутарата L-аланином, которое происходит под действием АлАТ, образуются пируват и L-глутаминовая кислота. Определение основано на измерении оптической плотности 2,4-динитрофенилгидразонов α-кетоглутарата и пирувата в щелочной среде. Поскольку гидразон пировиноградной кислоты имеет более высокий коэффициент молярной экстинции, то проявляется прямо пропорциональная зависимость оптической плотности реакционного раствора от активности фермента

Материалы и реактивы:

1. Субстратно-буферный раствор АлАТ:

- фосфатный буфер (0,10,005) мМ

- D, L- аланин (0,20,01) М

- 2-оксоглутаровая кислота (20,1) М

2. Стоп реагент (раствор 2,4-динитрофенилгидразина)

- (10,05) ммоль/л в растворе соляной кислоты (10,05) мМ

3. Калибровочный раствор - пировинограднокислого натрия (20,1) ммоль/л, (22011) мг/мл (что соответствует 176 мкг/мл пировиноградной кислоты)

4. Раствор гидроокиси натрия (40,2) М или сухой NaOH

Ход работы:

Анализ проводиться согласно схеме, приведенной в таблице 1.

Таблица 1

Отмерять в пробирку, Мл	Опытная или калибровочная проба	Холостая проба
Субстратно-буферный раствор	0,4	0,4
Инкубировать 3 мин. при + 37 0С
Стоп реагент	-	0,4
Сыворотка крови	0,08	0,08
Инкубировать 60 мин. при +37 0С
Стоп реагент	0,4	-
Выдерживать 20 мин. при комнатной температуре
Раствор гидроокиси натрия 0,4 Н	4,0	4,0
Выдерживать 10 мин. при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность опытной пробы против холостой.

Расчет активности фермента в сыворотке крови проводят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика проводится в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2 – Калибровочный график для 1 часа инкубации

Отмерять в пробирку, мл	Калибровочные точки					Контроль­ная проба
	1	2	3	4	5
Субстратно-буферный раствор	0,45	0,40	0,35	0,30	0,25	0,5
Калибровочный раствор	0,05	0,10	0,15	0,2	0,25	-
Дистиллированная вода или физиологический раствор	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Стоп реагент	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Выдержать 20 мин. при комнатной температуре
Раствор гидроокиси натрия 0,4 Н	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Выдержать 10 мин. при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность калибровочных проб против контрольной. Фотометрирование проводится, как для опытного образца. При построении калибровочного графика на оси абсцисс – величины активности АлАТ, выраженные в микромолях пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации.
Содержание пировиноградной кислоты в калибровочной пробе
Мкмоль	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,0
Мкг	8,8	17,6	26,4	35,2	44,0	0,0
Активность в мкмоль/час.мл	1,0	2,0	3,0	4,0	5,0	0,0
мккат/л	0,278	0,556	0,833	1,11	1,39	0,0

Линейность калибровочного графика должна сохраняться до величины экстинкции 0,35.

Нормальная активность АлАТ в сыворотке крови составляет (0,1-0,68) мкмоль/часмл при +37 ⁰С.

Клинико-диагностическое значение. Диагностическое значение имеют две аминотрансферазы: АлАТ и АсАТ. Повышение их активности в крови является чувствительным показателем нарушения функций печени и сердца.

Для диагностики инфаркта миокарда проводят определение активности следующих ферментов: АлАТ, АсАТ, креатинкиназы, ЛДГ. При инфаркте миокарда активность АсАТ в сыворотке крови поднимается, начиная с 8-12 часа; максимальная активность достигается через 24-36 часов, а её возвращение

К нормальному уровню происходит на 4-6 день. У больных с инфарктом миокарда активность АсАТ в сыворотке крови в 2-10 раз выше от верхнего значения нормы. Соотношение активности АлАТ/АсАТ при инфаркте миокарда в большинстве случаев превышает 2, а соотношение меньше 1 преимущественно указывает на поражения печени.

Повышенная активность ферментов в сыворотке крови при заболеваниях печени является следствием повреждения гепатоцитов. Такие повреждения, независимо от причины, вызывают увеличение активности аминотрансфераз не менее чем в 10 раз. Токсическое повреждение печени, например, при отравлении парацетамолом, приводит к повышению активности АлАТ и АсАТ в 50-100 раз. Значительное возрастание активности аминотрансфераз выявляют при вирусном гепатите.