Журнал Ветеринария

ния препаратов в средах на основе незасты- вающих компонентов). Водные заключающие среды обычно представляют собой буферные растворы, использованные при окраске и от- мывке препаратов. В качестве незастываю- щих заключающих сред для флуоресцент- ной микроскопии могут быть использованы нефлуоресцирующее иммерсионное масло, жидкий парафин, глицерин разной концен- трации, а также синтетические заключаю- щие среды на основе полимеров (полиизобу- тилметакрилат, полистирол) [6].

Использование в заключающих сре- дах фотозащитных добавок, таких как N-пропилгаллат, пара-фенилендиамин, прод- левает время флуоресценции в 15–30 раз – и это существенно для фиксации изображения. В настоящее время многие фирмы, производя-

щие различные реактивы, коньюгированные с флуорохромами, а также флуоресцентные красители, предлагают готовые заключающие среды с фотозащитными добавками [6].

Фотообесцвечивание может быть исполь- зовано до применения флуорофоров, свя- занных с антителами, для гашения ауто­ флуоресценции, что позволяет понизить фоновый уровень сигнала. Обесцвечивание светом может быть использовано для из- учения движения или диффузии молекул, например, при помощи метода FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) или FLIP (Fluorescence loss in photobleaching).

Эти методы применяется для измерения подвижности молекул посредством иници- ации фотохимического разложения флуоро­ хрома в зоне облучения (рис. 4).

После выжигания молекулы с флуоро­ хромом из необлученной зоны движутся посредством диффузии в облученную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции­ можно судить о подвижно- сти молекул [30].

Таким образом, литературные данные свидетельствуют, что исследования в обла- сти создания и применения ФФК, обеспе- чивающих возможность окрашивания кле- ток и субклеточных структур, находятся на важном этапе накопления сведений о раз- нообразии хромофорных соединений, по- тенциально перспективных для более слож- ных методик визуализации в биологической микроскопии. Кроме того, на примере ряда ФФК уже продемонстрированы возможно- сти окрашивания клеток и субклеточных

органелл. Достоинством ФФК является не только их стабильность во времени и устой- чивость к интенсивному фотооблучению, эффективность и управляемость процессом окрашивания в динамике, но и возможность «многоцветной» микроскопии для визуали- зации биохимических процессов на уровне органелл и крупных супрамолекулярных систем.

Литература

1.Владимирова Ю. А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю. А. Владимирова, Г. Е. Доб­ рецов. М: Наука. 1980. – 320 c.

2.Зайцев С. Компьютерное моделирование супрамолекулярной системы, состоящей из молекул флуоресцентных красителей,

липидов и воды / С. Зайцев, М. Шапош- ников, Д. Соловьева, М. Бартов, П. Во- лынский // Научная визуализация. 2012. Т. 4. № 3. C. 1–7.

3. Иванова С. В. Фундаментальные, кли- нические и фармацевтические проблемы патологии человека: сб. науч. трудов / С. В. Иванова, О. И. Кралько, И. П. Шту- рич // Витебск: ВГМУ. 2003. № 2. С. 191–

193.

4. Кузнецов А. Н. Метод спинового зонда. М.: Наука 1976. – 210 с.

5. Пальцев М. А. Патологическая анатомия: учебник / М. А. Пальцев, Н. М. Аничков. М.: Медицина, 2000. Т.1.– 528 c.

6. Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуо-

ресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: учебно-мето- дическое пособие / А. Ф. Сайфитдинова. СПб: СОЛО, 2008. – 72 с.

7. Смолина H. B., Грызунов Ю. А., Максимова H. M., Добрецов Г. Е., Узбеков М. Г.,

Мисионжник Э. Ю., Вертоградова О. П.

Свойства связывающих центров моле- кулы альбумина у больных тревожной депрессией: исследование методом ту- шения флюоресценции. Бюллетень экс- периментальной биологи и медицины 2007; (11):514–516.

8. Шерстнев К. Б. Люминесцентный ана- лиз в медицине и биологии и его аппа- ратурное обеспечение / К. Б. Шерстнев, Н. П. Милютина, В. В. Эстрин // Тез. докл. Рига: РМИ. 1985. C. 102–103.

9. Belov V. N., Rhodamines N. N. A novel class of caged fluorescent dyes / V. N. Be- lov, C. A. Wurm, V. P. Boyarskiy // Angew. Chem. Int. Ed., 2010. V. 49. P. 3520–3523.

10. Wolfbeis O. S. Fluorescence-based ion sensing using potential-sensitive dyes // Sensors and Actuators R: Chemical. 1995. V. 29. P. 140–147.

11. Basu M. Studies on the binding of 1-ani- lino-8-naphthalene sulfonate to very low density and high density human serum lipoproteins / M. Basu, J. Tinkelstein, S. Ghosh, J. Schudics // Biochim. et biophys. Acta. 1975. V. 398. P. 385.

12. Shinitzky M. Difference in microviscosity induced by different cholesterol levels in the surface membrane lipid layer of normal lymphocytes and malignant lympho-

ma cells / M. Shinitzky, M. Inbar // J. Mol. Biol. 1974. V. 85. P. 603.

13. Vanderkooi J. M. Interaction of general anesthetics with phospholipid vesicles and biological membranes / J. M. Vanderkooi, R. Landesberg, I. H. Selick, G. G. McDonald // Biochim. et biophis. acta. 1977. V. 464. P. 1.

14. Drabikowski W. Filipin as a fluorescent probe for the location of cholesterol in the membranes of fragmented sarcoplasmic reticulum / W. Drabikowski, E. Lagwiaska, M. Sarzala // Biochim. et biophis. acta. 1973. V. 291. P. 61.

15. Shechter E. Correlations between fluo- rescence, X-ray diffraction, and physio­ logical properties in cytoplasmic membrane vesicles isolated from Escherichia coli / E. Shechter, T. Gulik-Krzywicki, R. Azerad, C. Gros // Biochim. et biophis. acta. 1972. V. 274. P. 466.

16. Ellman G. L., Courtney K. D., Andres V. Jr. et al. // Biochemical Pharmacology. 1961. V. 7. P. 88–95.

17. Lidke D. S. Caught in the Act: Quantifying Protein Behavior in Living Cells / D. S. Lidke, B. S. Wilson // Trends Cell Biol. 2009. V. 11. P. 566–574.

18. Lippincott-Schwartz J. Studying protein dynamics in living cells / J. LippincottSchwartz, E. Snapp, A. Kenworthy // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. V.2. P. 444–456.

19. Neher R. A. Blind source separation techniques for the decomposition of multiply labeled fluorescence images / M. Mitkovski,

F. Kirchhoff, E. Neher, F. J. Theis, A. Zeug // Biophys. J. 2009. V. 96. P. 3791–3800.

20. Betzig E., Patterson G. H., Sougrat R., Lindwasser O. W., Olenych S., Bonifacino J. S.,

Davidson M. W., Lippincott-Schwartz J. and H. F. Hess. (2006) Imaging intracellu- lar fluorescent proteins at nanometer reso- lution. Science V. 313. P. 1642–1645.

21. HessS. T.,GirirajanT. P.andMasonM. D.

2006. Ultra-high resolution imaging by flu- orescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91(11): 4258–4272.

22. Rust M. J. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) / M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang // Nature Methods. 2006. V. 3. P. 793–795.

23.Moerner W. E. New Directions in SingleMolecule Imaging and Analysis // Invited Perspective, Proc. Nat. Acad. Sci. 2007.

V.104. P. 12596–12602.

24.Moerner W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images // Nature Methods 2006. V. 3. P. 781–782.

25.Andresen M. Photoswitchable fluorescent proteins enable monochromatic multilabel imaging and dual color fluorescence nanos- copy / M. Andresen, A. C. Stiel, J. Fölling,

D.Wenzel, A. Schönle, A. Egner, C. Eggeling, S. W. Hell, S. Jakobs // Nature Biotechnol. 2008. V. 26(9). P. 1035–1040.

26.Juškaitis R. A method for characterizing longitudinal chromatic aberration of microscope objectives using a confocal optical system / R. Juškaitis, T. Wilson // J. Microscopy. 1999. V. 195. P. 17–22.

27.SnareM. J. The photophysics of rhodamine

B/ M. J. Snare, F. E. Treloar, K. P. Ghiggino, P. J. Thistlethwaite // Journal of Photochemistry. 1982. Vol 18. P. 335–346.

28.Kim S. Y. Probing the sequence of conformationally induced polarity changes in the molecular chaperonin GroEL with fluores- cence spectroscopy / S. Y. Kim, A. N. Semyonov, R. J. Twieg, A. L. Horwich, J. Frydman, W. E. Moerner // J Phys Chem B. 2005. V. 109. P. 24517–25.

29.HarmsG.S.,CognetL.,LommerseP. H. M., Blab G. A., Schmidt T. Autofluorescent proteins in single-molecule research: applications to live cell imaging microscopy / G. S. Harms, L. Cognet, P. H. M. Lommerse, G. A. Blab, T. Schmidt // Biophysical. 2001. V. 80. P. 2396–2408.

30.Murray J. M. Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination methods // Live Cell ImagingA­ Laboratory Manual (Goldman R. D., Spector D. L., eds.) Press, Cold Spring Harbor, New York. 2005. P. 239–279.

References

1.Vladimirova Yu. A. (1980) Fluorescent probes in the study of biological mem- branes, р. 320.

2.Zaitsev S. (2012) Computer Modeling of the Supramolecular System Consisting of Fluorescent Dye, Lipid and Water Molecules.

Scientific visualization, vol. 4, no 3, pp. 1–7.

3.Ivanova S. V. (2003) Basic, clinical and pharmaceutical issues of human patho­ logy: Sb. scientific works, no 2, pp. 191–193.

4.Kuznetsov A. N. (1976) Method of spin probe, р. 210.

5.Paltsev M. A. (2000) Pathology: Textbook, vol 1, p. 528.

6.Sayfitdinova, A. F. (2008) Two-dimension- al fluorescence microscopy for the analysis of biological samples, p. 72.

7.Smolina N. V., Gryzunov Yu. A., Maximova N. M., Dobretsov G. E., Uzbekov M. G., Misionzhnik E. Yu., Vertogradova O. P. (2007) Characteristics of albumin molecule binding centers in patients with anx- ious depression. Study by the fluorescence quenching method, p. 674–676.

8.Sherstnev K. B. (1985) Luminescent analysis in medicine and biology, and its hard- ware, pр. 102–103.

9.Belov V. N. Rhodamines N. N. (2010) A novel class of caged fluorescent. Angew. Chem. Int. Ed., vol. 49, pp. 3520–3523.

10.Wolfbeis O. S. (1995) Fluorescence-based ion sensing using potential-sensitive dyes.

Sensors and Actuators R: Chemical, vol. 29,

pp.140–147.

11.Basu M. (1975) Studies on the binding of 1-anilino-8-naphthalene sulfonate to very low density and high density human serum lipoproteins. Biochim. et biophys. acta, vol. 398, p. 385.

12.Shinitzky M. (1974) Difference in microviscosity induced by different cholesterol levels in the surface membrane lipid layer of normal lymphocytes and malignant lymphoma cells. J. Mol. Biol, vol. 85, p. 603.

13.Vanderkooi J. M. (1977) Interaction of general anesthetics with phospholipid vesicles and biological membranes. Biochim. et biophis. acta, vol. 464, p. 1.

14.Drabikowski W. (1973) Filipin as a fluores- cent probe for the location of cholesterol in the membranes of fragmented sarcoplasmic reticulum. Biochim. et biophis. acta, vol. 291, p. 61.

15.Shechter E. (1972) Correlations between fluorescence, X-ray diffraction, and physio­ logical properties in cytoplasmic membrane vesicles isolated from Escherichia coli. Biochim. et biophis. acta, vol. 274,

p.466.

16. Ellman G. L., Courtney K. D., Andres V. Jr. et al. (1961) Biochemical Pharmacology, vol. 7, pp. 88–95.

17. Lidke D. S. (2009) Caught in the Act: Quantifying Protein Behavior in Living Cells. Trends Cell Biol, vol. 11, pp. 566–574.

18. Lippincott-Schwartz J. (2001) Studying protein dynamics in living. Nat. Rev. Mol. Cell Biol, vol. 2, pp. 444–456.

19. Neher R. A. (2009) Blind source separation techniques for the decomposition of multi- ply labeled fluorescence images. Biophys. J., vol. 96, pp. 3791–3800.

20. Betzig E., Patterson G. H., Sougrat R., Lindwasser O. W., Olenych S., Bonifacino J. S., Davidson M. W., Lippincott-Schwartz J., and H.F. Hess. (2006) Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolu- tion. Science, vol. 313, pp. 1642–1645.

21. Hess S. T., Girirajan T. P. and Mason M. D.

(2006). Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localiza- tion microscopy. Biophys J., vol. 91(11), pp. 4258–4272.

22. Rust M. J. (2006) Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods, vol. 3, pp. 793–795.

23. Moerner W. E. (2007) New Directions in Single-Molecule Imaging and Analysis.

Invited Perspective, Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 104, pp. 12596–12602.

24.Moerner W. E. (2006) Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Na- ture Methods, vol. 3, pp. 781–782.

25.Andresen M. (2008) Photoswitchable fluo- rescent proteins enable monochromatic multilabel imaging and dual color fluores- cence nanoscopy. Nature Biotechnol, vol. 26(9), pp. 1035–1040.

26.Juškaitis R. (1999) A method for characterizing longitudinal chromatic aberration of microscope objectives using a confocal optical system. J. Microscopy, vol. 195, pp. 17–22.

27.Snare M. J. (1982) The photophysics of rhodamine B. Journal of Photochemistry, vol. 18, pp. 335–346.

28.Kim S. Y. (2005) Probing the sequence of conformationally induced polarity changes in the molecular chaperonin GroEL with fluorescence spectroscopy. J Phys Chem B., vol. 109, pp. 24517–25.

29.Harms G. S., Cognet L., Lommerse P. H. M.,

Blab, G. A., Schmidt, T. (2001) Autofluores- cent proteins in single-molecule research: applications to live cell imaging microscopy. Biophysical, vol. 80, pp. 2396–2408.

30.Murray J. M. (2005) Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination methods. Live Cell Imaging­A Laboratory Manual, pp. 239–279.

КОЕ бактерий. Все четыре штамма выделе- ны из содержимого рубца теленка. Штаммы являются факультативными анаэробами го- моферментативного типа и остаются жизне- способными при температуре 60°С.

Основанием к применению данного про- биотика для силосования трудносилосуемой зеленой массы клевера послужило содер- жание в его составе лактобацилл, которые обладают полисахаридной активностью и способствуют более полному интенсивно- му гидролизу широкого спектра углеводов, в том числе таких, как крахмал и пектин, что способствует увеличению уровня простых сахаров, при сбраживании которых образу- ются органические кислоты – консерванты зеленой массы. Активное кислотообразова- ние приводит к быстрому подкислению си- лосуемой массы, которая характеризуется относительно низкой кислотностью и сниже- нию рН до оптимальных значений (4,0–4,3), что обеспечивает развитие молочнокислых бактерий и стабильное хранение корма дли-

тельное время. Лактобациллы также синте- зируют антибиотические вещества широкого спектра действия, ингибирующие бактерии родов Staphylococcus, Micrococcus, Escherichia, Streptococcus, Salmonella, Ente-rococcus,

препятствуют развитию грибов и дрожжей, которые могут вызвать вторичную фермен- тацию в силосе при его вскрытии.

Тетралактобактерин вносили в силосуе- мую зеленую массу клевера в сухом виде в различных дозах из расчета 50 г, 100 г, 150 и 200 г на тонну. В лабораторных условиях 500 г зеленой массы закладывали в темные стеклянные ёмкости, плотно утрамбовыва- ли и герметично закрывали. Устанавлива- ли водяной затвор для учета выделившихся при брожении газов, по количеству которых рассчитывали потери питательных веществ.

Было заложено пять вариантов силоса в трёх повторностях. В кон-трольном вари- анте клеверную массу силосовали по обыч- ной технологии без добавления препарата, в опытных вариантах – с пробиотиком (табл. 1).

Таблица 1

подкисления среды и рН стабилизируется на уровне 4,31. От общего содержания орга- нических кислот на долю молочной прихо- дится 72,53%, или на 12,39 абсолютных про- цента больше контроля. Масляная кислота не накапливалась. Аммиака в силосе опыт- ного варианта образовалось на 34,4% мень- ше, чем в силосе без пробиотика, что ука- зывает на низкий гидролиз белка и более высокую (на 6,83%) его сохранность. В сило- се с пробиотиком отмечается значительное (на11,6%) снижение количества клетчатки. Это отразилось на энергетической питатель- ности силоса. Содержание обменной энер- гии в опытном варианте силоса превышало контрольный на 11,25%.

Известно, что одним из показателей, определяющим качество корма является его

переваримость. Результаты опыта показы- вают, что перевари-мость сухого вещества силоса, заложенного с ТЛБ в дозе 100 г/т массы на 7,01% выше, чем без препарата.

Таким образом, на основании получен- ных экспериментальных данных можно сделать следующий вывод: использование пробиотика тетралактобактерина в каче- стве консерванта при силосовании зеленой массы клевера лугового способствует повы- шению питательности силоса и переваримо- сти сухого вещества корма.

Литература

1.Асатиани В. С. Новые методы биохими- ческой фотометрии. М.: Наука. 1985.

2.ГОСТ 24230-80. Метод определения пе- реваримости invitro.

3.ГОСТ 23638-79. Силос из зеленых расте- ний.

4.Казанцев А. А., Пышманцева Н. А. Ис-

пользование пробиотических добавок в кормопроизводстве // Кормопроизвод- ство. 2012. № 8. С. 44–46.

5.Курилов Н. В., Севастьянова Н. А., Кор-

шунов В. Н. и др. Изучение пищеваре- ния у жвачных: методические указания. Боровск: ВНИИФБиП с.-х. животных. 1979. – 139 с.

6.Петраков Е. С. Становление микробио- ценоза кишечника, морфологические показатели крови и неспецифическая резистентность у телят при использо- вании новых пробиотических штаммов лактобацилл. Автореф. канд. биол. наук. Боровск, 2010. – 23 с.

7.Петухова Е. А., Бессарабова Р. Ф., Халанева Л. Д., Антонова А. О. Зоотехниче-

ский анализ кормов. М.: Агропроиздат, 1989. – 239 с.

8.Разумов В. А. Справочник лаборанта-хи- мика по анализу кормов. М.: Россельхо- зиздат, 1986. – 304 с.

9.Тараканов Б. В. Использование пробиоти- ков в животноводстве. Калуга, 1998. – 53 с.

References

1.Asatiani V. S. (1985) New methods of biochemical photometry.

2.GOST 24230-80 Method of Determination of Digestibility of in Vitro.

3.GOST 23638-79. Silo from green plants.

4.Kazantsev A. A., Pyshmantseva N. A. (2012) Use of pro-biotic additives in a forage production. Forage production, no. 8, pp. 44–46.

5.Kurilov N. V., Sevastyanova N. A. Korshunov V. N., etc. (1979) The study of digestion in ruminants, p. 139.

6.Petrakov E. S.(2010) Formation of a microbiocenosis of intestines, morphological in- dicators of blood and nonspecific resistance at calfs when using strains of lactobacilli new the probiotiche, p. 23.

7.Petukhova E. A., Bessarabova R. F., Halaneva L. D., Antonova A. O. (1989) Zootekhnichesky analysis of forages, p. 239.

8.Razumov V. A. (1986) Reference book of the laboratory assistant-chemist on the analysis of forages, p. 304.

9.Tarakanov B. V. (1998) Use of probiotics in animal husbandry, p. 53.