Метод иммуноблотинга (Western blot)

Метод иммунного блотинга позволяет произвести элек-трофоретическое разделение вирусных белков (Аг) с последую­щим перенесением их на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем мембрана обрабатывается испытуемой сывороткой. Заключитель­ный этап исследования состоит в выявлении антител к различ­ным белкам возбудителя, для чего в систему добавляют антивидо­вые меченые сыворотки.

Индикацию образовавшихся иммунных комплексов проводят с использованием иммуноферментного или радиоиммунного ана­лиза. С помощью метода иммунного блотинга определяют анти­тела к одному или нескольким белковым антигенам возбудителя; используется в лабораторной диагностике вирусных инфекций, например, СПИДа.

АЛЛЕРГИЯ

Проблема измененной реактивности организма при­влекает внимание экспериментальной и клинической медицины более 90 лет, то есть со времен Ш, Рише и П. Портье, описав­ших в 1902 году синдром, который наблюдался при вторичном введении собакам белка анемон (морских звезд): быстрое паде­ние артериального давления, судорожные сокращения гладкой мускулатуры, диспное и смерть. Этот феномен авторы обозначи­ли термином «анафилаксия» (от греч. аnа — против, phyloxis — защита).

Основоположником учения об аллергии считается К. Пир­ке, определивший аллергиюкак специфически измененную ре­активность организма по отношению к продуктам или живым агентам, которая возникает под влиянием предыдущего взаимо­действия с этим агентом, то есть при его повторном действии. Что мы сегодня знаем об аллергии?

Аллергия — это:

1) иммунологический механизм, участвующий во всех прояв­лениях гуморального и клеточного иммунитета с различным уров­нем выраженности. При напряженной защитной функции имму­нитета аллергические реакции, как правило, носят нормергический

118

характер и фоново усиливают иммунологический ответ. В случае недостатка гуморального и клеточного иммунитета аллергические реакции характеризуются как гиперергические и наряду с защит­ным эффектом способны выступать как фактор, определяющий заболевание. При недостатке функций иммунитета и запредель­ном антигенном раздражении проявления аллергии исчезают, на­ступает состояние анергии. При этом патологический процесс протекает особенно злокачественно;

2) результат «иммунологического» контакта организма со сла­быми или неполноценными антигенами;

3) профаза иммунитета, проиммунитетная стадия.

Изучение повышенной чувствительности организма к повтор­ному воздействию высокомолекулярных соединений позволило разделить этиологические факторы аллергии на две большие груп­пы: экзоаллергены и эндоаллергены.

Основную часть экзоаллергенов составляют продукты биоло­гического (грибкового, бактериального и вирусного) происхож­дения. Сюда же отнесены высокомолекулярные лекарственные средства и относительно простые химические соединения, пыль­ца трав, цветов, бытовая пыль, мелкие частицы эпидермиса, во­лос, перхоти, а также пищевые продукты растительного и живот­ного происхождения.

Эндоаллергены(аутоантигены) разделяются на естественные (первичные); приобретенные (вторичные).

Вторичные делятся на неинфекционные (ожоговые, лучевые, холодовые) и инфекционные. Инфекционные подразделяются на комплексные (ткань + микроб, ткань + токсин) и промежу­точные (продукты поврежденной ткани микробами или виру­сами).

Приведенная общая схема классификации аллергенов свиде­тельствует о чрезвычайно большом числе веществ, в результате воздействия которых наступает аллергическая: перестройка орга­низма.

Что же объединяет эти разнообразные аллергены? Уже гово­рилось, что аллергические реакции развиваются на слабые или неполноценные антигены. В аллергической терминологии они на­зываются гаптенами. Общим свойством для них является способ­ность соединяться с собственными белками организма и через него реализовывать аллергическую активность. Такой белок на­зывается «трактор-антигеном» или «шлеппер-белком».

Таким образом, иммунологическая реакция на гаптен (экзо-и эндоаллерген) является реакцией против собственных белков. Именно поэтому аллергические реакции сочетают полезные и вредные свойства. В отличие от иммунного процесса, протекающего от патологии к норме, аллергический процесс, по определению Rabka (1939), протекает «от нормы к патологии».

119

Аллергический процесс имеет три основные стадии развития (по А. Адо):

иммунологическая— в организме на основе процесса сенси­билизации образуются аллергические антитела (реагины), кото­рые фиксируются на клеточно-тканевых структурах;

патохимическая— происходит соединение образовавшихся антител с повторно поступающим аллергеном, в результате чего нарушаются обменные процессы в клетках, содержащих на своей поверхности антитела, клетки разрушаются и высвобождаются медиаторы аллергии — гистамин, МРВ-А, серотонин и другие медиаторы воспаления. Благодаря этому повышается проницае­мость капилляров, формируется воспалительный отек;

патофизиологическая— клинически проявляются расстройст­ва функций организма, свойственные аллергической реакции.

Итак, в основе аллергических процессов лежит феномен сен­сибилизации организма, основанный на попадании в него аллер­гена.

Пути поступления аллергена в организм:

парентеральный;

ингаляционный; ,

накожный;

энтеральный.

Для инфекционных аллергенов пути поступления совпадают с путями проникновения возбудителя в организм.

Следует отметить, что степень выраженности аллергической реакции зависит от пути поступления аллергена в организм и мас­сивности его дозы. ,

Аллергические реакции организма развиваются по трем основ­ным путям:

гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ);

гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ: базофильный и туберкулиновый типы);

аллергические реакции позднего типа.

Гиперчувствительность немедленного типа— аллергическая реакция, развивающаяся не позднее 2 часов после повторного контакта с аллергеном на фоне предварительной аллергизации (табл. 2). Обуславливается антителами, относящимися к IgЕ и IgЕ-подобному субклассу иммуноглобулинов. Эти антитела циркули­руют в крови и диффундируют в ткани, где фиксируются на по­верхности клеток. Разрешающее введение в организм аллергена сопровождается немедленной анафилаксией с крайним выраже­нием в виде анафилактического шока с потерей сознания, резким снижением артериального давления, одышкой и высокой вероят­ностью смертельного исхода.

К проявлениям ГНТ следует отнести и сывороточную бо­лезнь — симптомокомплекс, развивающийся на однократное внут-

120

Таблица 2

Типы реакций гиперчувствительности

Особенность реакции	ГНТ	ГЗТ
		базофильная	туберкули­новая

Перенос:

лимфоцитами — + +

антителами + + —

Участие :

гистамина + + —

в микробной аллергии — — +

в противопаразитарном

иммунитете + + —

Стимуляция:

адыовантом Фрейнда — — +

коклюшным антигеном : + + —

Состав клеток, участвующих Базофилы, Базофилы, В основном

в реакции эозинофилы эозинофилы, мононукле-

в меньшей ары

степени моно-

нуклеары

римышечное или внутривенное введение в организм чужеродной сыворотки, других лекарственных препаратов и природных со­единений. Сывороточная болезнь часто протекает по типу анафи­лаксии. Ее развитие связано с иммунными комплексами, в кото­рых участвуют IgЕ, IgМ и IgD.

Гиперчувствительность замедленного типа(базофильного ти­па) — сочетает проявления ГНТ и ГЗТ, развивается преимущест­венно с участием базофилов, нейтрофилов и частично с IgЕ. Характерна для проявлений трансплантационного иммунитета, па­разитарных, клещевых, вирусных инфекций.

Гиперчувствительность замедленного (туберкулинового) типа вызывается большинством микробных антигенов. В формирова­нии ГЗТ принимают участие различные субпопуляции Т- и В-лимфоцитов, базофилы, тучные клетки, макрофаги.

Аллергические реакции позднего типаустановлены сравнительно недавно. Развиваются с участием тучных клеток, эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов, проявляются к моменту исчезнове­ния ГНТ в виде эритемы и волдыря, характеризуются отеком, крас­нотой, уплотнением кожи (не менее 10 мм без четких границ), рассасываются через 24—48 часов с последующим образованием петехий. ,

Все вышеизложенное можно обобщить в основных законах аллергии:

повторность аллергического воздействия на организм;

121

изменение скорости, интенсивности, качества биологических процессов в сенсибилизированном организме;

организм, сенсибилизированный к одному виду аллергии, может ответить аллергической реакцией на введение другого, близ­кого по природе аллергена — параллергена;

развитие аллергических реакций, как результата несовмести­мости антигена и антител;

появление аллергических реакций при передозировках, нару­шении схем введения препаратов;

аллергический статус может быть снят, если аллерген приме­нен фракционно, в минимальных количествах, в сроки, соответ­ствующие десенсибилизации.

Для выявления сенсибилизации и предупреждения .развития аллергических реакций применяют аллерго-иммунологические тесты, основанные на введении в организм внутрикожно мини­мальных количеств предполагаемого аллергена и исследовании его соответствия крови (антителам, клеткам).

АУТОИММУННЫЕ ПРОЦЕССЫ

Иммунологическая система осуществляет строгий контроль за внутренним гомеостазом организма, физиологичес­ким соответствием отдельных клеток и систем, их взаимодей­ствием в обеспечении общего процесса жизнедеятельности. Веду­щим при этом является иммунологический эффект супрессии — запрет реакции на «свое».

Однако изменение антигенной структуры тканей, их физио­логическая или патологическая деградация, в результате которой образуются секвестрированные антигены, а также нарушения различных звеньев в системе иммуиитета, например в результате соматических мутаций иммунокомпетентных .клеток, приводит к развитию аутоиммунитета— реакции иммунной системы лротив собственных тканей.

Возникновение аутоиммунных процессов может быть опосре­дованным (в результате травм, инфекционного или иного заболе­вания) или непосредственным— связанным с дисфункцией Т-супрессоров и развитием цитотоксического контроля иммунной системы антигенов собственных тканей.

Следует отметить, что аутоиммунный контроль является фи­зиологическим свойством иммунной системы, и поэтому в кро­ви всегда присутствуют так называемые «нормальные антитела» в пороговых титрах, контролирующих клеточное обновление в фи­зиологических пределах (теория «транспортеров»). Это связано с тем, что иммунные антитела организма содержат аутореактивные Т- и В-лимфоциты, функции которых- аутораспознавание,

122

направленное на сохранение аутотолерантности и поддержание

антигенного гомеостаза.

Поддержание аутотолерантности обеспечивается:

-- инактивацией антигенных клонов;

- ингибицией антителообразующих лимфоцитов;

- регуляцией Т-лимфоцитов.

Согласно L. J Nossel (1975), в процессе дифференциации В-лимфоцитов от стволовой до зрелой плазматической клетки существует фаза, когда их контакт с антигеном проявляется только толерантностью, но не иммунитетом. В этот период В-лимфо­циты приобретают поверхностные IgМ. Эти антитела блокируют рецепторы, а незрелые В-лимфоциты неспособны их восстанав­ливать.

Участие Т-лимфоцитов в аутотолерантности достигается либо

активацией Т-супрессоров, либо инактивацией Т-хелперов.

Аутоиммунитет — проявление нормальной реакции иммун­ной системы в патологических условиях.

К развитию аутоиммунного заболевания ведут три главных

механизма:

- высвобождение антигена;

-обходной шунт (Т-се11 Bupass);

-нарушение иммунологической регуляции.

Моделирование аутоиммунных реакций в эксперименте:

- введение в кровеносное русло «забарьерных тканевых анти­генов;

-введение собственных антигенов с адъювантом Фрейнда;

-мимикрирующие антигены и микробы (микробные «продук­ты» со свойствами адъюванта Фрейнда). Вирусы внедряясь в кле-

точные мембраны, придают инфицированным клеткам чужеродность и вызывают реакцию иммунокомпетентных клеток.

Аутоиммунное заболевание может бытъ вызвано перекрестно реагирующими антигенами, когда антитела вырабатываются и к аутологичным антигенам, и микробным детерминантам. Так, стрептококки имеют антигенную общность с антигенами миокарда, базальных мембран почечных клубочков. На этой ос­нове формируется патогенез ревматизма, хронического нефрита и т. д.

В результате накопления лекарств некоторые собственные ткани могут приобретать чужеродные антигенные свойства (лекарство — ткань), попадая под иммунологический контроль организма.

Аутоантигенами могут быть неэлиминированные макромоле-

кулы «эмбриональных зачатков».

В возникновении аутоиммунных болезней значительная роль принадлежит генетическим факторам. Почти все аутоиммунные заболевания связаны с изменением главного комплекса гистосов-

123

местимости ( HLA-аллелями). У многих больных обнаруживается НLА-В8 гаплотип.

Аутоиммунные заболевания чаще встречаются у женщин. С воз­растом частота аутоиммунных заболеваний увеличивается.

Аутоантигены

Аутоантигены— вещества собственных нормальных тканей, у которых в эмбриогенезе отсутствует контакт с иммунокомпетентными клетками (забарьерные антигены).

К забарьерным антигенам не формируется иммунологическая толерантность, поскольку содержащие их органы отделены от крови гистогематическими барьерами. Чаще всего аутоантитела вырабатываются к собственным тканевым компонентам, измененным под действием лекарств, токсинов и ферментов бак­терий, вирусов.

Классификация аутоаллергёнов поАдо:

-естественные, первичные — антигены забарьерных тканей (хрусталик, нервная ткань и т. д.);

-приобретенные, вторичные:

неинфекционные, образующиеся при действии термофак­тора, ионизирующего излучения;

инфекционные, возникающие в результате воздействия на ткани микробных токсинов;

Аутоантителообразование возникает как результат:

соединения экзогенного гаптена с белком организма хозяина;

освобождения антигенов, в норме не контактирующих с им-мунокомпетентными клетками (антитела к хрусталику при травме глаза, к миокарду — при инфаркте и т. д.);

изменения структуры макромолекул под влиянием биологи­ческих факторов (например, вирус гриппа за счет гемолизина обна­жает внутренние структуры эритроцита и активирует антиэритро-цитарные антитела);

появления в организме комплексов, антигенно сходных с де-терминантамихозяина, но конъюгировавших с другим носителем (стрептолизин-0);

соматических мутаций, при которых могут появляться кло­ны клеток, реагирующие против собственных неизмененных ан­тигенов.

Модели аутоиммуниых процессов

Аутоиммунные заболеванияразвиваются в результате появления в организме «запрещенных» клонов иммунокомпе-тентных лимфоидных клеток при генетических аномалиях. Экс­периментом это подтверждается при использовании ксеноген-

124

ных и аллогенных животных, иммунизированных тканевыми ан­тигенами. Так, мыши линии NZBспонтанно заболевают сходным с СКВзаболеванием. В возрасте двух—четырех месяцев у них спонтанно появляются антиэритроцитарные антитела, повыша­ются концентрации Т- и В-клеток, способных реагировать на аутоантигены, теряется супрессорная активностьв отношении корпускулярных и растворимьх антигенов, нарушается диффе­ренциация Т-клеток за счет дисфункции тимуса.

Аутоиммунные реакции индуцируются в эксперименте in vivo многими простыми химическими соединениями, например хлором и нитропроизводными бензола, которые легко связываются с белками морских свинок и становятся аутоантигенами.

Моделью для изучения ЦПД аутоантител in vitro служат куль­туры тканей Не1а фибробластов, щитовидной железы и др. Добав­ление соответствующих антител прекращает образование моно­слоя, а в образованном вызывается ЦПД.

Роль аутоантител

Нормальные аутоантитела обнаруживаются в сыворотке всех позвоночных, синтезируюших антитела, почти ко всем органам и тканям. С возрастом у человека повышается сенсиби­лизация к основному протеину мозга, коррелирующая с титрами циркулирующих антител. Окончательно еще не, выяснено — это физиологический эффект, направленный на иммунологический контроль чисто биохимических сдвигов, или нарушение толеран­тности к собственным антигенам.

В соответствии с концепцией регуляторной роли аутоанти­тел считается, что аутоантитела нейтрализуют продукты метаболизма клеток, поступающие в кровь. При повреждении кле-ток их количество уменьшается поэтому аутоантитела проникают в ткани и фиксируются на поверхности клеток, что приводит к повышению проницаемости клеточных мембран и клеточного обмена. При резко выраженных повреждениях клеток возникают необратимые нарушения проницаемости мембран клеток и наступает лизис,.

Аутоантитела могут оказывать протективный эффект. Так, обработка лизосом сывороткой больных гепатитом снижает ин­тенсивность высвобождения лизосомальных ферментов под действием ретинола и предупреждает повреждение макрофагов.

При аутоиммунных процессах в сыворотке крови появляются полные и неполные аутоантитела. Их роль окончательно не уста­новлена. Избыточное содержание не связанных с антигеном аутоан­тител ставит под сомнение их участие в динамике аутоиммунного процесса. Однако надо принимать во внимание авидность и авидитет сывороток. Кроме того, измененные секвестрированные

125

антитела способны не только к индукции антителообразования, но и к сенсибилизации Т-лимфоцитов.

Под влиянием аутоантител повреждения возникают в результате реакции антиген—антитело При развитии аутоиммунных за-болеваний комбинировано участвуют и аутоантитела, и сенсиби­лизированные лимфоциты. На формирование аутоантител могут оказывать действие бактерии за счет антигенов мимикрии и адъювантного действия.

Аутоиммунные повреждения удается воспроизвести путем переноса аутоантител при экспериментальном гломерулонефрите.

Аутоантитела встречаются практически при всех заболева-ниях:сердечно-сосудистой системы, органов дыхания, крови и кроветворных органов, мочеполовой системы, пищеваритель­ного тракта, печени, кожи, инфекционных болезнях, поражени­ях соединительной ткани, опорно-двигательного аппарата, глаз и т. д.

Существуют тепловые (термические) аутоантитела(IgМ и IgD) с оптимумом реагирования при 37 °С и холодовые аутоантитела (неполные аутоантитела, способные проникать через плаценту) с оптимумом реагирования около 4 °С. К последним относятся неполные гемагглютинины — антиэритроцитарные антитела.

Значительно чаще и в более высоких титрах при аутоиммун­ных заболеваниях встречаются холодовые антитела, являющиеся неполными агглютининами класса IgМ.

Механизм развития аутоиммунных болезней может быть обус­ловлен нормальными холодовыми аутрантителами против Т-лим-фоцитов. Они появляются у здоровых людей в возрасте 60—70 лет, оказывают депрессивный эффект на неспецифические звенья ре-зистентности и иммунные механизмы.

Холодовыми являются также аутоантитела против Fc-фраг­ментов IgG, антитела против антигенов НLА.При переохлажде­нии холодовые аутоантитела адсорбируются на цитомембране клет­ки и разрушают ее.

Тепловые аутоантитела к Т-лимфоцитам в основном ингйби-руют функцию Т-супрессоров.