Любая питательная среда должна содержать необходимые для размножения легкоусвояемые вещества; иметь оптимальную влаж­ность, вязкость, рН, быть изотоничной, прозрачной, стерильной биология вирусов

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ С КЛЕТКАМИ

Вирусные частицы, или вирионы являются инертны­ми, статическими формами вируса. Когда вирионы находятся вне клетки, они не репродуцируются. В настоящее время известно три типа взаимодействия вирусов с клетками хозяина.

Продуктивныйтип взаимодействия заканчивается образова­нием вирусного потомства.

Абортивныйтип не завершается образованием вирусных час­тиц, поскольку инфекционный процесс прерывается и не сопро­вождается формированием инфекционного потомства.

Интегративныйтип взаимодействия вирусов с клеткой харак­терен для онкогенных вирусов, нуклеиновая кислота которых спо­собна встраиваться (интегрироваться) в клеточную хромосому, вызывая трансформацию клеток. Границы между вирусами с ав­тономной репликацией геномов и интеграционными вирусами довольно условны, и один и тот же вирус, в зависимости от вида клеток, может вести себя либо как инфекционный, либо как ин­теграционный геном. Результатом такого взаимодействия вируса и клетки является изменение наследственных свойств клетки. Данный тип взаимодействия вируса и клетки называютвироге-

60

нией,подобно лизогении при взаимодействии фагов с бактерия­ми. Вирусы, способные вызывать вирогению, относят к группе умеренных.

Продуктивный тип взаимодействия вируса и клетки получил название репродукции вирусов (от англ. rерroduсе — воспроизво­дить).Репродукция вирусов —это образование по принципу комплементарности и путем репликации копий вирусных нуклеиновых кислот и индуцирование молекулами последних биосинтеза вирусных белков с последующей самоорганизацией этих компонентов в вирусные частицы.

Синтез и репликацию нуклеиновых кислот вирусов осуществляют ферменты. Используя нуклеотиды клетки, ферменты создают из них полинуклеотидные цепи новых молекул нуклеиновых. кислот вирусов. В зависимости от типа синтезируемых нуклеиновых кислот они называются ДНК-полимеразами или РНК-синтетазами. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты вирусов реплицируются клеточными полимеразами — ферментами, присутствующими в клетке до ее заражения вирусом, хотя чаще репликацию вирусных нуклеиновых кислот осуществляют полимеразы, появляющиеся после заражения клетки вирусом. Такие полимеразы называют вирусспецифическими, так как биосинтез их закодирован в структуре нуклеиновых кислот самих вирусов. И, наконец, репликация нуклеиновых кислот некоторых вирусов происходит за счет предсуществующих в вирионе полимераз. Синтез вирусспецифических полимераз и вирусных структурных белков осуществляется на рибосомах клетки. Вирусные полимеразы, например РНК-репликазы, являются строго специфичными.

При большом разнообразии механизмов репродукции вирусов общим для них является то, что источником мономеров для синтеза и репликации нуклеиновых кислот служат нуклеотиды клетки. Источником мономеров для синтеза и построения белков всех вирусов являются аминокислоты, и синтез белков всех вирусов независимо от ультраструктуры их нуклеиновых кислот осуществляется в клеточных рибосомах. Источником энергии для биосинтетических процессов при репродукции вирусов является АТФ, которая вырабатывается в митохондриях клет­ки-хозяина.

Процесс репродукции вирусов включает шесть этапов: адсор­бцию вируса на клетке; проникновение в клетку; депротеинизацию и освобождение вирусного генома; синтез вирусных компо­нентов в клетке-хозяине; сборку и формирование вирусов; выход зрелых вирусов из клетки.

Адсорбция,то есть прикрепление ви руса к клетке, осущес­твляется специфическими и неспецифическими механизмами. Неспецифический — определяется силами электростатического

61

взаимодействия. В этом процессе участвуют положительно заря­женные аминные группы вирусного белка и кислые фосфатные группы клеточной поверхности, имеющие отрицательный заряд. Специфический механизм взаимодействия вируса и клетки обус­ловлен комплементарными клеточными и вирусными рецепто­рами. Вирусные рецепторы подразделяют на липопротеиновые (у арбовирусов) и мукопротеиновые (у миксовирусов и аденовирусов). Спектр чувствительности клеток к вирусам часто опреде­ляется наличием соответствующих рецепторов.

Резистентность клеток можно преодолеть путем разрушения клеточной мембраны, для чего используют инактивированный вирус Сендай. Специфические противовирусные антитела и ан­титела к нормальным клеткам препятствуют адсорбции виру­сов. Процесс адсорбции состоит из двух периодов — обратимого и необратимого. Период обратимой адсорбции может закончить­ся десорбцией вируса. При длительном контакте клеток и вируса наступает стадия необратимой адсорбции. Адсорбированные вирионы таким образом могут частично элюироваться с поверхнос­ти клеток, небольшая часть остается интактной, а основная масса вирусных частиц проникает в клетку.

Проникновение вирусов в клеткуосуществляется путем ви-ропексиса, или пиноцитоза. При этом в месте адсорбции вириона происходит сначала инвагинация наружной мембраны клетки и образование внутриклеточной вакуоли с вирусной частицей. Че­рез некоторое время вирусная и клеточная мембраны вакуоли лизируются и высвобождается нуклеокапсид вируса. Другие виру­сы, например вирус Неrреs simр1ех, проникают в клетку не путем виропексиса, а расплавления мембран вируса и клетки. После расплавления вирусный нуклеопротеид оказывается в цитоплаз­ме. Большинство вирусов проникают в клетку путем виропекси­са, меньшинство видов — путем сплавления. У фагов этот про­цесс, то есть освобождение ДНК и ее последующая инъекция сквозь оболочку бактериальной клетки, происходит непосредст­венно на поверхности этой клетки сразу же после прикрепления к ней фага.

Депротеинизация,или «раздевание» происходит постепенно в несколько этапов. Процесс освобождения вирусной нуклеино­вой кислоты идет при активном участии самого вируса, индуци­рующего образование в клетке ферментов и активаторов фермен­тов, необходимых для депротеинизации вирусной нуклеиновой кислоты. В процессе депротеинизации вирусов могут участвовать ферменты клеточных лизосом. Таким образом, депротеинизация завершается освобождением вирусного генома.

Как только вирусный геном освобождается от белка, вирус­ная нуклеиновая кислота дезорганизует работу клеточных систем. Вирус стимулирует синтез ингибитора клеточных РНК. Ингиби-

62

тор представляет собой белок — гистон, кроме того блокирующий процесс синтеза клеточной ДНК. Второй «ранний» вирусный белок препятствует осуществлению функции клеточной и-РНК. Термин «ранние» обозначает молекулы, синтезированные до репликации ДНК.

Реализация генетической информации вирусов осуществля­ется в соответствии с процессами транскрипции — синтеза ин­формационных РНК, комплементарных матричным ДНК или РНК; трансляции — синтеза белков на рибосомах клетки с участием и-РНК; репликации — синтеза молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному (рис. 7).

| Синтез вирусных ДНКу ДНК-содержащих вирусов осущес­твляется с помощью ДНК-полимераз. Благодаря участию этого фермента из нуклеотидов клетки синтезируется и строится вторая комплементарная нить ДНК, в результате чего образуются новые двухцепочечные молекулы ДНК. Процесс репликации молекул ДНК продолжается до тех пор, пока в клетке не накопится определенное их количество, необходимое для потомства вирусной частицы, проникшей в клетку.

Поскольку типы и формы нуклеиновых кислот разнообразны — кроме двухцепочечной ДНК могут быть РНК, одно- и двухцепочечные, линейные и кольцевые молекулы — то и механизмы их репликации различны.

У вирусов, содержащих двунитевую РНК,синтез вирусных компонентов происходит сходным образом. «Ранняя» транскрип­ция у них осуществляется благодаря вирионному ферменту — РНК-зависимой РНК-полимеразе. Вирусы с однонитевой РНК по характеру синтеза белков разделяются на две группы: вирусы,

Вирусные белки в т. ч. ферменты

ОАО

Новые молекулы вирусной ДНК

Рис. 7. Схема репликациодвухцепочечных молекул вирусных ДНК и передачи генетической информации в рибосомы

63

И-РНК(+)

Вирусные белки в т. ч. РНК-репликаза

Транскриптаза ———————^

Вирусная РНК

ОАО

Новые молекулы вирусных(-) РНК

Рис. 8. Схема репликации вирусных минус-РНК и передачи генети­ческой информации в рибосомы

у которых РНК обладает информационными свойствами и на­правляет синтез специфических белков (пикорна- и тогавирусы);

вирусы, у которых РНК не является информационной, а служит только матрицей для синтеза и-РНК (ортомиксо-, парамиксо-, рабдовирусы) (рис. 8).

Особым способом репликации отличаются РНК-содержащие двухцепочечные ретровирусы. Существенное отличие состо­ит в том, что у них имеется фермент — РНК-зависимая-ДНК-полимераза, с помощью которой на матрице вирионной РНК синтезируется ДНК-провирус кольцевой формы. Этот провирус встраивается в клеточную хромосому и транскрибируется клеточ­ной РНК-полимеразой точно так же, как и обычные клеточные гены. Образующаяся РНК направляет синтез вирусных белков и одновременно является вирионной РНК. Вирусная нуклеино­вая кислота кодирует синтез двух классов белков: неструктурных белков — ферментов, которые обеспечивают процесс репродук­ции вирусов на разных его этапах, и структурных белков, кото­рые войдут в состав вирионов потомства. Наряду с синтезом бел­ков в клетке при репродукции вирусов, имеющих суперкапсид, например, вируса гриппа, происходит синтез углеводных цепей, входящих в состав гликопротеидов. Присоединение углеводов осуществляется с помощью клеточных ферментов трансфераз, син­тез липидов суперкапсида — клеткой-хозяином. Вирусный суперкапсид формируется при включении липидов из плазматической мембраны клетки-хозяина. Синтез вирусных нуклеиновых кис­лот и вирусспецифических белков происходит почти одновре-

64

менно и не менее чем на час опережает созревание вирусных частиц.

Сборка и формирование вирионовосуществляется после достижения критической концентрации нуклеиновой кислоты и белка так как чисто физико-химическая реакция агрегации белка с вирусными нуклеиновыми кислотами. Так, у парамиксовирусов формирование вирионов происходит путем самосборки, которая обусловлена «узнаванием» РНК белками. Вероятно, «узнающим» белком вляется белок Р, который наиболее жестко связан с РНК в вирионах. Нуклеокапсиды накапливаются в цитоплазме зараженных леток, причем скорость образования внутриклеточных нуклеокапсидов гораздо выше скорости образования вируса. Зрелые ви­русные сложноустроенные частицы формируются при прохождении их нуклеопротеидов через цитоплазматическую или ядерную мембрану клетки-хозяина.

Компоненты этих мембран становятся элементами наружной оболочки вириона — суперкапсида. Заключительная стадия репро-дукции вирусов — выход вновь сформированных вирионов из клетки. У различных групп вирусов этот процесс происходит по-разному. При выходе из клетки вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки, как правило, клетка погибает из-за взрывного выхода одновременно большого количества вирусных частиц. Вирусы, имеющие суперкапсидную оболочку, выходят из клетки путем почкования. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложноустроенных вирусов фиксируются на клеточной мембра­не, модифицированной вирусными белками, и постепенно вы­пячивают ее, в результате чего образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки, то есть внеш­няя суперкапсидная оболочка этих вирусов формируется в про­цессе их выхода из клетки.

При таком механизме выхода вирионов из клеткипоследняя сохраняет в определенной мере свои функции. Так, например, процесс выхода вирусов гриппа может продолжаться более 30 ча­сов. Герпесвирусы могут выходить из клетки через цитоплазматические трубочки, соединяющие ядерную оболочку с наружной мембраной клетки. Благодаря такому механизму выделения эти вирусы передаются от клетки к клетке, не выходя во внешнюю среду. Образовавшиеся в процессе репродукции вирионы могут инфицировать новые клетки и проходить в них новый цикл реп­родукции.

Интегративный тип взаимодействия характеризуется встраи­ванием нуклеиновой кислоты вируса в хромосому клетки-хозяи­на. При этом вирусный геном функционирует как составная часть клеточного генома. Интегративный тип взаимодействия присут­ствует у бактериофагов, онкогенных вирусов, вируса гепатита В, вирусов герпеса и вируса иммунодефицита человека. В частности,

5 «Микробиология»

65

умеренные фаги вступают в симбиоз с частью бактерий, при этом ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В данном случае геномом фага называют профаг, ставший частью хромосомы бак­терии и не вызывающий ее лизиса.

Симбиоз микробной клетки с умеренным фагом называют лизогенией. Самопроизвольно или под действием ультрафиолета, или химических факторов профаг может из хромосомы перехо­дить в цитоплазму и вести себя как вирулентный фаг, лизирующий бактерии.

У онкогенных вирусов и вируса иммунодефицита человека процесс интеграции является обязательным в цикле их репродук­ции. У этих вирусов на матрице РНК с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы синтезируется ДНК-копия, кото­рая встраивается в хромосому клетки. ДНК вируса, находящаяся в составе хромосомы клетки, называется ДНК-провирусом. Клет­ка сохраняет свои функции и при делении передает ДНК-провирус дочерним клеткам.

Таким образом, состояние вирогении наследуется. ДНК-про-вирус несет дополнительную генетическую информацию, поэто­му интеграция является причиной некоторых аутоиммунных и хро­нических заболеваний, опухолей. Под действием некоторых физических и химических факторов ДНК-провирус может выре­заться из клеточной хромосомы и переходить в автономное состо­яние, включаясь в цикл репродукции.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

Культивирование вирусов осуществляют для лабора­торной диагностики вирусных заболеваний человека и живот­ных, изготовления живых и инактивированных противовирусных вакцин и сывороток, изучения вопросов патогенеза и иммуни­тета.

Культивирование вирусов в организме естественно воспри­имчивых животных проводят в том случае, если исследователь заинтересован сохранить у вируса исходную патогенность и анти­генные свойства.

Культивирование вирусов в организме лабораторных живот­ных ограничено из-за невосприимчивости животных ко многим

вирусам человека.

Одним из наиболее доступных и удобных методов для выде­ления и культивирования вирусов является использование кури­ных эмбрионов. В куриных эмбрионах способны размножаться вирусы с различным тропизмом, поскольку они содержат четыре субстрата для вируса — амнион, алантоис, хорионаллантоисную мембрану и желточный мешок.

66

Индикацию вирусов в куриных эмбрионах осуществляют по характеру поражения тела и оболочек эмбриона, а у гемагглюти-нирующих вирусов — в реакции гемагглютинации (склеивания эритроцитов).

Вирусы — это абсолютные внутриклеточные паразиты, ко­торые не способны размножаться ни в одной из бесклеточных питательных сред. В 1949 году Д. Эндерс, Т. Уэллер и Ф. Роббинс сообщили о том, что вирус полиомиелита может размно­жаться и вызывать характерные изменения в культурах не из нервной ткани. Благодаря этому открытию стало возможным выращивание вирусов в клеточных культурах, а также удалось выделить и описать множество ранее неизвестных вирусов. От­крытие аденовирусов, эхо- и риновирусов, разработка вакцин против полиомиелита, кори и краснухи непосредственно связа­ны с использованием культур клеток.

Для культивирования различных вирусов используют первич­ные, диплоидные и перевиваемые клеточные линии.

Первичные культуры клетокполучают из измельченных жи­вотных тканей, обрабатывая их протеолитическими ферментами. После отмывки и подсчета клеток суспензию разбавляют средой и дают возможность клеткам прикрепиться к плоской поверхнос­ти стеклянной или пластмассовой посуды. Клетки быстро при­крепляются к поверхности и при оптимальных условиях делятся примерно один раз в день. Первичные или первичнотрипсинизи-рованные культуры клеток осуществляют не более пяти—десяти делений. Для лабораторных исследований и производства вакцин их получают из эмбриональных тканей человека (почек, амниона), обезьян, мышей, куриных эмбрионов.

Диплоидные клеточные культурыпредставляют собой клетки фибробластов, полученные из эмбрионов человека. Они могут осу­ществлять до 100 делений, сохраняя при этом свой исходный дип-лоидный набор хромосом.

Перевиваемые клеточные линии— это клетки одного типа, способные размножатьсяinvitrо неопределенно долго, их полу­чают из трансформированных клеток. Часто они теряют сходст­во с теми клетками, от которых произошли, претерпевая в тече­ние длительного культивирования последовательные мутации. Перевиваемые клеточные линии Нер-1, Нер-2, Не1а и КВ ведут н ачало от карцином человека. Эти линии, а также линии, проис­ходящие от клеток тканей мышей (L929), хомячков (ВНК-21) широко используются в экспериментальной вирусологии.

О размножении вирусов в культуре клеток можно судить по датопатическому эффекту — ЦПЭ (см. вкл. IV); образованию в клет-:ах вирусных включений; бляшкам в клеточном монослое; явле­нию гемадсорбции; изменению цвета индикатора питательной среды для клеток.

67

СОХРАНЕНИЕ ВИРУСОВ И ВИРУССОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА

Вирусы можно сохранять при положительных темпера­турах, в замороженном и лиофилизированном состоянии.

Стабильность вирусов при положительных температурах не­велика. Продолжительность хранения отдельных видов вирусов даже при температурах, близких к нулю (2-4°С), исчисляется несколькими днями. Инактивация вирусов при положительных температурах происходит за счет действия различных групп фер­ментов вирусного и субстратного происхождения.

Неочищенные взвеси вирусов хранят в холодильнике при тем­пературе минус 40—70°С.Чем ниже температура хранения, тем лучше сохраняются вирусы и вируссодержащие материалы.

В настоящее время наиболее совершенным способом хране­ния вирусов является замораживание (криоконсервирование) при температуре от минус 165°С (в парах жидкого азота) до минус 196° С (в жидком азоте). При такой температуре некоторые ви­русы сохраняют ультраструктуру и биологические свойства в те­чение трех—пяти лет. Поэтому метод криоконсервирования ши­роко используется при создании криобанков вирусов.

Некоторые виды вирусов можно сохранять путем высушива-ния в вакууме из замороженного состояния способом лиофилизации (сублимации). Так, например, можно сохранить вирусы бе­шенства и полиомиелита.

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Генетика — наука об изменчивости и наследственнос­ти организмов. Основателем учения об изменчивости и наслед­ственности является Ч. Дарвин, доказавший в 1859 году, что все существующие виды растений и животных произошли из немно­гих исходных форм в результате изменчивости.

В 1906-1907 годах М. Нейссер и Р. Манссини описали появ­ление «дочерних» колоний кишечной палочки, в отличие от мате­ринской не ферментировавших лактозу. В настоящее время цен­тральное место в генетике микроорганизмов по-прежнему занимает интенсивное изучение кишечной палочки (Еscherihiа соli) и ее многочисленных вирусов-паразитов. Новым направлением в ге­нетике микроорганизмов является генная инженерия, с помощью которой можно в определенной степени управлять наследствен­ностью микроорганизмов.

Явление наследственности связано со спецификой молекул ДНК, которые программируют процессы индивидуального разви­тия особей бактерий. У высших растительных и животных организмов

68

вся генетическая информация заложена в ядре, содержащем полный набор хромосом. Аналог ядра у бактерий представлен нуклеоидом, состоящим из одной уложенной или развернутой молекулы ДНК. Генетический материал бактерий представлен ДНК, в молекулах которой закодирована информация о структуре клеточных белков. Двунитевая молекула ДНК-хромосомы бактерии кишечной палочки состоит из 1,7×10⁷нуклеотидных пар. Ее молекулярная масса составляет примерно 3 % сухой массы клетки бактерий. Единицей наследственности является ген, представляющий собой участок ДНК, в котором зашифрована последовательность аминокислот в полипептидной цепи, харак­теризующий отдельный признак особи. В отличие от растений и животных бактерии преимущественно являются гаплоидными — содержат одинарный набор генов и совмещают функции гаметы и особи. Синтез каждого фермента, или более точно полипептидной цепи контролируется отдельным геном генома. Если в геноме бактерии отсутствует ген данного фермента, этот фермент не может быть синтезирован. ДНК представляет собой длинный полимер-полинуклеотид. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания — аденина, гуанина; цитозина или тимина и остатка сахара дезоксирибозы и фосфатной группы, с помощью которых нуклеотиды соединяются между собой.

Генетический кодсоставляет особая последовательность нук-

леотидов на определенном участке ДНК. Последовательность ос- нований в ДНК характеризует собой структурную единицу — кодон, который кодирует каждую из 20 аминокислот, входящих в состав белков.

Генотип— это комплекс генов, наследственно переданный особи материнской клеткой. Комплекс внешних и внутренних при­знаков бактерий, таких как форма, размеры, окраска, химический состав, биохимические и микроскопические особенности соот­ветствуют фенотипу, то есть внешнему проявлению генотипа. Про­цесс синтеза белка, закодированный в молекулах ДНК, осущес­твляется в несколько этапов и требует участия трех типов РНК:

информационной (матричной) — и-РНК; транспортной — т-РНК;

рибосомальной — р-РНК. Информационная РНК образуется при помощи специфического фермента РНК-полимеразы на матри­це молекулы ДНК. При этом генетическая информация, опреде­ляемая типом последовательности чередования нуклеотидов, ко­пируется в молекуле и-РНК. Этот этап передачи информации называется транскрипцией.

Информационная РНК направляется к рибосомам, находящим­ся в цитоплазме. У всех живых организмов рибосомы представляют собой рибонуклеопротеиды, содержащие 63 % РНК и 37 % белка. Лучше других рибосомы изучены у кишечной палочки. Метабо­лически активные рибосомы Е. соliимеют константу седимента-

69

ции 70S. В среде, содержащей двухвалентные ионы, они обрати­мо диссоциируют на составляющие 50S и 30Sсубъединиц. Рибосомы бактерий содержат три типа собственной рибосомальной РНК: 5S; 16S; 26S. Кроме РНК субъединицы рибосом имеют ин­дивидуальные белки. Предполагают, что белки выполняют функ­ции формирования структуры рибосом и центров связывания ак­тивизированных аминокислот, а также обеспечивают правильность считывания матрицы.

Перевод четырехбуквенного (А, Т, Г, Ц) языка нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) на язык протеинов называется трансляцией.

Реализация наследственной информации происходит в опре­деленных условиях внешней среды. Различия в условиях среды накладывают свой отпечаток на развитие особей бактерий. Поэ­тому развитие бактерий необходимо рассматривать как следствие действия двух важнейших факторов — действия генотипа; влия­ния на особь факторов среды. Под влиянием физических, хими­ческих и биологических воздействий некоторые микроорганиз­мы могут изменять свои морфологические признаки, принимая форму больших шаров, утолщенных нитей, колбовидных обра­зований, ветвлений и т. д. Явление морфологических изменений у микробов Н. Ф. Гамалея назвал гетероморфизмом.Гетеромор­физм легко возникает под влиянием солей лития, а также фага, кофеина, сульфаниламидов, антибиотиков, различных излучений, действия магнитных полей и других факторов. Любое изменение морфологических признаков, как правило, сопровождается изме­нением и физических свойств. Например, при посеве на плотную питательную среду чистой культуры образуются колонии двух ос­новных типов: гладкие — S-формы (от англ. smoth— гладкий); шероховатые — R-формы (от англ.rough— шероховатый). Такого рода изменчивость получила названиедиссоциации.

Изменчивость бактерий затрагивает и их потребности в мета­болитах. Под влиянием антибиотиков, химических веществ, ульт­рафиолетового облучения у некоторых микробов появляется пот­ребность в витаминах, аминокислотах, факторах роста, в которых не нуждались исходные штаммы. Таким образом, в отличие от исходных прототрофов эти микроорганизмы превращаются в ауксотрофов.

Под действием некоторых веществ могут изменяться фер­ментативные свойства бактерий. Индукцию биосинтеза фермента -галактозидазы у Е.соП можно воспроизвести культивировани­ем этой бактерии в присутствии лактозы.

Очень важным моментом является то, что под влиянием раз­личных факторов изменяется степень патогенности у болезнетвор­ных микробов.

В 1881 году Л. Пастер разработал метод получения живой вакцины против сибирской язвы. В течение 12—24 дней культи-

70

вирования сибиреязвенной бациллы при повышенной темпера­туре (42—43 °С) микробы потеряли способность вызывать забо­левание у животных при подкожном введении, сохранив при этом иммуногенные свойства. Используя этот пастеровский принцип, в 1883 году Л. С. Ценковский создал живую противосибиреязвенную вакцину, состоящую из взвеси спор ослабленных сиби­реязвенных бактерий.

В 1885 году Л. Пастер изменил свойства возбудителя бешен­ства путем проведения 133 последовательных пассажей через мозг кроликов. При подкожном введении вирус оказался безвредным и в то же время способным предупреждать возникновение заболе­вания у людей, укушенных бешеными животными.

Ослабленный штамм микобактерий туберкулеза бычьего вида был получен во Франции в 1919 году А. Кальметтом, Ш. Гереном путем длительного пассирования на картофельной среде с желчью и глицерином при температуре 38°С в течение 13 лет через каждые 14 дней. Полученный штамм был назван вакциной БЦЖ (ВСG— от фр. Васilе Са1mеtte-Guеrin), которую применяют для прививок против туберкулеза.

Изменчивость микроорганизмов, возникающая под действи­ем факторов внешней или внутренней среды, которая не сопро­вождается изменением структуры генотипа называется ненаслед­ственной фенотипической изменчивостью.Например, культура кишечной палочки на среде с рициноолеатом натрия растет в виде длинных нитей, а при добавлении хлорида кальция клетки стано­вятся очень короткими. Глицерин и аланин обусловливают поли­морфизм у холерных вибрионов.

В процессе снижения степени патогенности микроорганиз­мов — аттенуации происходят наследственные генотипические изменения химического состава бактерий. У микобактерий тубер­кулеза уменьшается содержание липидов, у возбудителя чумы — белка, у туляремийных бактерий и бруцелл — снижение способ­ности липидов к комплексообразованию.

При воздействии пенициллином, химическими веществами или иммунными сыворотками на стафилококки, микобактерии тубер­кулеза и многие другие бактерии возникают L-формы бактерий, у которых нарушается синтез клеточной стенки. Микробная клетка превращается в большой шар с вакуолями, гранулами, зернистостью.

МУТАЦИИ

При необратимой утрате определенных звеньев биосинтеза клеточной стенки бактерии способны перевиваться в L-форме независимо от наличия в среде пенициллина и других трансфор-|мирующих агентов. В данном случае наблюдается наследственная генотипическая изменчивость, связанная с мутациями — мутаци-

71

онная изменчивость.Мутации, ведущие к изменению генотипа, всегда наследственно закреплены. Различаютнуклеоидныемута­ции, происходящие в нуклеоиде, ицитоплазматическиемутации — в ДНК цитоплазмы. Мутации могут сопровождаться изменением последовательности нуклеотидов ДНК, выпадением (делеция) или добавлением (дупликация) одного основания или небольшой груп­пы оснований.

По происхождению бактериальные мутации подразделяются на спонтанные, образующиеся под воздействием внешних факто­ров без вмешательства экспериментатора, и индуцированные, воз­никающие вследствие обработки микробной популяции мутагенными факторами.

По механизму действия на геном микробной клетки мутации подразделяются на:

точечные или мелкие, при которых в результате замены, встав­ки или выпадения одной пары азотистых оснований ДНК внутри самого гена изменяется, как правило, лишь генетический при­знак бактериальной клетки. При точечных мутациях может на­блюдаться спонтанная (самопроизвольная) или индуцированная реверсия, то есть восстановление утраченного или утрата приоб­ретенного признака;

крупные или множественные, при которых в основном на­блюдается летальный исход;

супрессорные — это эффекты приобретения или утраты при­знака, непосредственно не связанного с действием мутагена на структурный ген, ответственный за этот признак. Закономерным исходом супрессорных мутаций является восстановление исход­ного генетического статуса.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ рекомбинации

Среди микроорганизмов широко распространен и та­кой вид изменчивости как генетическая рекомбинация,которая может происходить в результате трансформации, трансдукции и конъюгации. В эволюционном процессе рекомбинации игра­ют второстепенную роль. Главным поставщиком эволюционно­го материала являются мутации.

Суть явления генетической рекомбинации состоит в том, что в реципиентную клетку попадает лишь фрагмент экзогенной ДНК бактерии-донора, который взаимодействует с цельной хромосо­мой реципиента, в результате чего происходит перераспределе­ние — рекомбинация генетического материала с образованием рекомбинанта, имеющего признаки обоих родителей. Полученные рекомбинанты — это клетки, в которых полноценная хромосома состоит из хромосомы реципиента с включенными в нее фраг­ментами хромосомы донора.

72

Для осуществления возможности скрещивания донор должен обладать свойством фертильности (от англ. fertilitу — плодовитость). Фертильность определяется по способности бактерий адсорбировать специфические донорские фаги на поверхностных пилях, синтез которых детерминируется F-плазмидой, или на специфических участках поверхности клетки-донора при отсутствии таких пилей у некоторых видов бактерий. Рекомбинация может произойти при наличии у реципиента рекомбинационных генов, а также при отсутствии факторов ограничения экспрессии чужеродной ДНК.

Трансформация

Трансформация — передача генетической информации путем введения в клетку реципиента изолированной ДНК бактерии-донора. Поскольку эффективность трансформации зависит от степени гомологии структуры ДНК донора и реципиента, она более эффективна в пределах одного вида.

Трансформация возможна, когда у реципиента возникает состояние компетентности, заключающееся в изменении проницаемости клеточной стенки, позволяющее проникать в клетку высокомолекулярным структурам донорской ДНК. На поверхности клетки-реципиента находятся специфические ферментативно активные рецепторы, на которых адсорбируются фрагменты ДНК донора и затем проникают в клетку. Проникшие фрагменты расщепляются на комплементарные нити, из которых одна включается в хромосому реципиента. Трансформирующая активность ДНК очень высока. Достаточно 10 — 15 минут ее контакта с исследуемой культурой, чтобы вызвать начало изменчивости, которая завершается через 2 часа. При трансформации от донора к реципиенту могут передаваться гены, определяющие резистентность к антибиотикам, фаголизабельность и другие свойства микроорганизмов. При существенных различиях в степени гомологии нуклеотидного состава ДНК-компонентов донора и реципиента частота получения трансформантов ограничена. Тем не менее, межвидовая трансформация получена у бактерий родов Neisseria,Bacillus, Streрtососcus.

Трансдукция

Трансдукция— перенос генетической информации от донора реципиенту посредством умеренных бактериофагов, которые в отличие от вирулентных не всегда вызывают лизис бактериальной клетки. В явлении трансдукции принимают участие бактерия-донор, трансдуцирующий фаг и бактерия-реципиент. Умеренные бактериофаги могут находиться в цитоплазме бакте-

73

рии в автономном состоянии или включаются в структуру ДНК в виде профага. В интегрированном состоянии геном умеренно­го фага передается потомству клетки наравне с другими хромо­сомными генами. Переходя в автономное состояние, эти фаги могут присоединять к собственному геному небольшие фрагменты хромосомы, расположенные рядом с местом включения в нее профага. При инфицировании новых бактерий умеренные фаги, несущие хромосомные гены, выполняют функции переносчика генетического материала. Различают три вида трансдукции: об­щую, или неспецифическую, специфическую и абортивную.

При общейтрансдукции может быть передан любой участок хромосомы бактерий или несколько участков, определяющих це­лый ряд наследуемых признаков.Специфическаятрансдукция осуществляется группой фагов, которые способны трансдуцировать гены, расположенные рядом с местом включения генома фага в нуклеоид бактерий при ее лизогенизации. Некоторые уме­ренные фаги сальмонелл и шигелл осуществляют лизогенную или фаговую конверсию антигенов одновременно с лизогенизацией клетки-реципиента. При конверсии вместе с фагом передается фрагмент хромосомы, контролирующей синтез соматического ан­тигена, что изменяет антигенную структуру реципиента.

Важное значение имеет фаговая конверсия у дифтерийных бактерий. Один из умеренных фагов Соrуnеbacteriumdiphteriае одновременно с лизогенизацией сообщает бактериям свойство токсигенности. У этих бактерий способность синтезировать ток­син находится под генетическим контролем генома фага и исче­зает одновременно с его утратой.

При абортивнойтрансдукции внесенный фагом фрагмент нук-леоида не включается в нуклеоид реципиента; он находится в ци­топлазме и при делении передается только одной клетке, вторая дочерняя клетка содержит генетический аппарат реципиента.

Широкое распространение лизогенности у стафилококков и энтеробактерий позволяет предположить значительное влияние трансдукции на формирование атипичных бактерий, что ведет к осложнению эпидемиологического анализа. Наглядно это про­является в антигенной конверсии, влекущей за собой изменение антигенной структуры близкородственных бактерий, у которых основу дифференциальной диагностики составляет серологичес­кая характеристика.

Конъюгация

Конъюгация— половой путь передачи генетического материала при непосредственном контакте клеток донора и ре­ципиента. Необходимое условие — наличие у донора фактора F-фертильности. У грамотрицательных бактерий обнаружены по-

74

ловые F-пили — длинные тонкие белковые трубочки, контроли­руемые F-фактором. Через F-пили при конъюгации происходит перенос генетического материала от донора к реципиенту. Клет­ки-доноры обозначают F⁺, клетки-реципиенты — F^-. Скрещива­ние F⁺и F^-, сопровождается плодовитостью, а F^-× F^-— бесплод­ностью. Диаметр канала пилей у Е. соliдостигает 25 А°, это позволяет проходить через него нити ДНК донора при контакте с клеткой реципиента.

Внехромосомные элементы, с участием которых совершаются процессы конъюгации, называются конъюгативными плазмидами. Конъюгативная плазмида —это внехромосомная генетическая структура бактерий, представляющая собой замкнутое кольцо двунитевой ДНК, находящейся в цитоплазме в автономном состоя­нии и ориентирующая на передачу хромосом, будучи с нею в ин­тегрированном состоянии. Плазмиды несут необязательные для клетки-хозяина гены и придают бактериям дополнительные свой­ства, которые могут им обеспечивать преимущества по сравне­нию с бактериями, не имеющими плазмид.

К конъюгативным плазмидам относят фактор фертильности, а также плазмиды, контролирующие резистентность бактерий од­новременно к нескольким лекарственным веществам (R-плазмиды); плазмиду Еnt, регулирующую синтез энтеротоксина у пато­генных эшерихий; плазмиду Н1у — обеспечивающую синтез гемолизинов; плазмиды, контролирующие синтез поверхностных антигенов кишечной палочки — К-88, К-99 и др.

Внедряясь в клетку реципиента, конъюгативные плазмиды со­общают ей свойства донора. Они остаются в цитоплазме, сохра­няя автономное состояние, и реплицируются независимо от хро­мосомы или встраиваются в структуру хромосомы — переходят в интегрированное состояние. Находясь в автономном состоянии, плазмиды могут быть выведены из клетки путем ее обработки ак­ридиновыми красителями и некоторыми другими веществами. Особенность конъюгативных плазмид — наличие в их структуре генетического элемента трансмиссивности — фактора передачи — trа, обеспечивающего передачу генетической информации. Плаз­миды, не имеющие такой частицы и соответственно неспособные к самопередаче, называются неконъюгативными.К ним относятся туберкулоцины, пестицины, вибриоцины — то есть некоторые факторы синтеза антагонистических субстанций.

В последнее время изучается роль плазмид в формирова­нии условно-патогенных бактерий, поскольку условно-патоген­ные и патогенные микроорганизмы различаются степенью ста­бильности генетических факторов, контролирующих инвазивность и продукцию эндо- и экзотоксинов. Патогенный эффект у лизогенных сальмонелл может усиливаться по сравнению с нелизогенными бактериями за счет высвобождения эндотоксина при их

75

лизисе в результате спонтанной или индуцированной активации профагов. Плазмида Еnt сообщает бактерии-хозяину способность продуцировать энтеротоксины. Особенности полиплазмидных систем условно-патогенных бактерий необходимо учитывать при лабораторной диагностике острых энтеритов, токсикозов, коли-бактериозов при отсутствии облигатнопатогенных возбудителей заболевания.

Плазмиды являются удобной моделью для генной инжене­рии, широко используются для получения рекомбинантных штам­мов. Кроме того, благодаря возможности конъюгационной пере­дачи плазмид не только внутри вида, но и между видами и родами плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий.

УЧЕНИЕ ОБ ИНФЕКЦИИ

Между микробом и макроорганизмом существует не­сколько форм симбиотических отношений (от лат. simbios— со­жительство): мутуализм — взаимовыгодные отношения двух орга­низмов; комменсализм — оба организма не принося пользы, не причиняют вреда друг другу; паразитизм — один из партнеров по симбиозу испытывает вредное воздействие со стороны другого. Паразитизм широко распространен в природе. Микробы-парази­ты возникали по мере появления растительного, а затем животно­го мира и в процессе эволюции проспосабливались к существова­нию в одном или ограниченном числе видов высших организмов. Явление паразитизма представляет интерес для медицинской мик­робиологии, поскольку на основе этой формы взаимоотношений между микробом и макроорганизмом появились инфекционные болезни.

Инфекция

Микроорганизм Макроорганизм Внешняя среда (факторы)

токсины/капсула продукты восприим- резистент- социальные биологи-/ метаболизма чивость ность \ ческие

инвазивность агрессивность гомеостаз инфекционная болезнь особенности классификация

по источникам по механизму передачи

Рис. 9. Схема взаимодействия факторов, участвующих в инфекцион­ном процессе

76

Инфекция(от лат. infесtiо — заражать) — процесс сложногоактивного взаимодействия макроорганизма с микроорганизмом, внедрившимся в его ткани и органы.

Инфекционный процесс —совокупность физиологических за­щитных и патологических процессов, развивающихся в организ­ме в результате внедрения в него болезнетворного (патогенного) микроба.

Инфекционная болезнь —крайняя степень проявления инфекционного процесса, сопровождающаяся рядом характерных симптомов. Клиническая картина бешенства отличается ,от заболева-уция дизентерией, брюшного тифа — от сыпного тифа.

Для возникновения инфекционного процесса, заболевания необходимо взаимодействие трех факторов (рис. 9): патогенный

микроорганизм; восприимчивый макроорганизм; условия окружающей среды, в том числе и социальные.

МИКРООРГАНИЗМ И ИНФЕКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС

Роль микроорганизма в возникновении инфекционного процесса впервые была определена в 1840 году Я. Генле и позднее уточнена Р. Кохом в его триаде, согласно которой:

возбудитель заболевания может быть обнаружен только у больных;

из организма больного его нужно выделить в чистой культуре;

выделенная культура возбудителя должна вызывать заболевание у восприимчивых лабораторных животных.

В свое время триада Генле — Коха сыграла положительную роль, поскольку в ней были сформулированы условия, которым должен отвечать микроб — возбудитель инфекционного заболевания,

В настоящее время триада во многом утратила свое значение. Сейчас не вызывает сомнения возможность обнаружения возбу­дителя не только у больных с клинически выраженной формой заболевания, но и у практически здоровых лиц — бактерионосителей. Хорошо известно, что при ряде заболеваний, вызванных риккетсиями, вирусами, выделить возбудителя в чистой культуре не всегда удается, так как он не растет на искусственных пита­тельных средах. И, наконец, весьма большое число патогенных микробов не могут вызвать у экспериментальных животных ти­пичной клинической картины заболевания в связи с тем, что ко многим из них у животных имеется видовая устойчивость (сифи­лис, гонорея, брюшной тиф).

Патогенность -потенциальная способность микроорганиз­мов определенного вида вызывать инфекционный процесс, мо­жет быть реализована только в восприимчивом организме, явля­ется видовым, генетически обусловленным признаком.

77

Патогенный микроб обладает специфичностью, то есть каж­дый отдельный вид возбудителя вызывает только определенную болезнь. Некоторые микроорганизмы являются условно-патоген­ными: в обычной среде они существуют в организме (на коже, слизистых оболочках, в кишечнике) как сапрофиты, но при ослаблении сопротивляемости человека или животного могут ста­новиться паразитами. К ним принадлежат: Е.соli, Strерtососсus fаесаlis, Рsеudomonas aeruginosa, Cаndidaаlbicаns, и др.

Вирулентность —индивидуальный признак патогенного мик­роба, определяющий степень или меру патогенности. У различ­ных штаммов одного вида микроорганизмов вирулентность раз­лична, ее можно измерить условно принятыми единицами:

DLМ (dosis1еtаlisminima) — наименьшее количество микро­бов, которое вызывает гибель 95 % зараженных восприимчивых лабораторных животных определенного вида и стандартной массы;

LD₅₀— минимальная доза микроорганизмов, вызывающая гибель 50 % экспериментальных животных.

Вирулентность не является постоянным признаком и подвер­жена изменениям. Повышению вирулентности способствует воз­действие на микроорганизм благоприятных факторов. Попадание микроба в среду, неблагоприятную для его развития, нередко приводит к снижению вирулентности. Искусственное снижение вирулентности путем культивирования микробов на неподходя­щих средах, пассажей через невосприимчивый организм, внесе­ния в питательные среды антибиотиков, различных химических веществ, воздействия повышенной или пониженной температуры и т. д. применяется для получения аттенуированных (ослаблен­ных) вакцин. Таким образом, вирулентность представляет собой довольно пластическое свойство, подверженное изменчивости как в естественных, так и в экспериментальных условиях.

Материальную основу вирулентности составляют: капсула, токсины, ферменты вирулентности.

Капсулазащищает патогенный микроб от воздействия фаго­цитов и антител при попадании в макроорганизм.

Токсины— микробные яды. Различают экзотоксины и эндо­токсины, отличающиеся целым рядом свойств.

Экзотоксины легко диффундируют в окружающую среду из клетки в процессе ее жизнедеятельности. По химической природе являются белками, термолабильны, очень ядовиты, обладают спе­цифичностью действия, то есть поражают определенные органы и системы (столбнячный токсин — двигательные нейроны спин­ного мозга, дифтерийный — сердечную мышцу и надпочечники), вызывают образование в организме антител — антитоксинов. При действии формалина и температуры 39—40°С утрачивают ядови­тость. Экзотоксины, лишенные ядовитых свойств, но сохранив-

78

шие антигенную структуру и иммуногенность, называются ана­токсинамии используются в качестве препаратов для профилак­тических прививок.

Сильные экзотоксины продуцируют некоторые грамположительные микроорганизмы: возбудители дифтерии, столбняка, газовой гангрены, ботулизма.

Эндотоксины прочно связаны с бактериальной клеткой и поступают во внешнюю среду только после ее гибели и разрушения. Имеют липополисахаридную природу, термостабильны, менее ядовиты. Попав в организм, вызывают явления общей интоксикации, а в качестве ответной реакции — образование антибактериальных антител. Под действием формалина обезвреживаются частично. Большинство патогенных бактерий содержит эндотоксин (возбудитель брюшного тифа, паратифов, дизентерии, коклюша и др.).

Ферменты вирулентностиспособствуют проникновению (ин-вазивность) и распространению (инфекционность) микробов в организме. К ним относятся: гиалуронидаза, расщепляющая гиалуроновую кислоту (мукополисахарид) соединительной ткани; фибринолизин, лизирующий фибрин кровяного сгустка; коагулаза, свертывающая плазму крови; лецитиназа, разрушающая оболочку клеток крови и различных органов; гемолизины, растворяющие эритроциты и лейкоцидины, разрушающие лейкоциты. Некоторые патогенные микробы (возбудитель чумы, сибирской язвы) продуцируют агрессины — вещества, нейтрализующие антитела; антифагины, препятствующие фагоцитозу.

Вирулентным микробам присущи также адгезия и колонизация.

Адгезия— способность адсорбироваться на определенных, чувствительных к данному возбудителю заболевания клетках ор­ганизма хозяина. Обусловлена, с одной стороны, поверхностны­ми структурами микробной клетки (пили), с другой — наличием рецепторов клетки макроорганизма, способных вступать в соеди­нение с микробной клеткой.

Колонизация— способность микробов размножаться либо на поверхности клетки макроорганизма, к которой они прикрепи­лись (холерные вибрионы на энтероцитах), либо внутри клеток, куда проникают микробы (дизентерийная палочка в клетках тол­стого кишечника).

МАКРООРГАНИЗМ И ИНФЕКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС

Возможность возникновения инфекционного процесса определяется не только количеством и качеством патогенного мик­роба, но и состоянием макроорганизма, его сопротивляемостью, восприимчивостью.

79

Воспрдимчивость обусловлена наличием в организме опреде ленных клеток, тканей в которых микроб-паразит находит опти­мальные условия существования. Человек наиболее восприимчив к тем заболеваниям, которыми болеют только люди (сифилис, дифтерия и др.) и невосприимчив к заболеваниям, поражающим животных (чумка собак, чума свиней).

Важным условием возникновения инфекционного процесса является внедрение патогенного микроба в организм через опре­деленные входные ворота (место проникновения возбудителя). Дизентерийные, брюшнотифозные микробы, холерный вибрион вызывают инфекционный процесс, попав в организм через рот; возбудители газовой гангрены, стовбняка — через раневую повер­хность; вирусы гриппа, кори — через слизистые оболочки верх­них дыхательных путей и т. д. Возникновению и развитию ин­фекционного процесса способствуют недоедание, переохлаждение, переутомление, хроническое отравление алкоголем, авитаминозы. Все это ведет к ослаблению организма, снижению его защит­ных сил. Одним из тяжелых последствий голодания является то, что при недостатке белков уменьшается выработка организмом защитных веществ (антител), активность фагоцитов.

Большую роль в восприимчивости организма к инфекции иг­рает гиповитаминоз. Недостаток витамина А снижает барьерную функцию кожи, способствует возникновению гнойно-воспалитель­ных процессов на коже. Гиповитаминоз В и С повышает воспри­имчивость к туберкулезу, дифтерии, стрептококковым, стафило­кокковым поражениям.

Заболевания нервной и эндокринной систем способствуют возникновению и более тяжелому течению инфекционных болез­ней (гнойно-воспалительные процессы при диабете).

На восприимчивость к инфекции оказывает также известное влияние возраст, пол. Ко многим заболеваниям дети более вос­приимчивы, чем взрослые (корь, скарлатина, паротит). У людей пожилого возраста заболевания протекают тяжелее.

Определенные физиологические состояния женского организ­ма при неблагоприятных условиях могут понизить сопротивляе­мость к инфекции.

ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА И ИНФЕКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС

К факторам окружающей среды следует отнести кли­матические условия. Охлаждение или перегревание понижает ус­тойчивость организма к патогенным и условно-патогенным мик­роорганизмам. В осенне-зимний сезон повышается заболеваемость гриппом и другими респираторными заболеваниями. На севере отмечена более высокая заболеваемость скарлатиной, чем на юге.

80

В условиях жаркого климата чаще регистрируются кишечные заболевания, в частности, амебная дизентерия.

Развитию инфекционных болезней способствует ионизирую­щая радиация в повышенных дозах, длительное и интенсивное действие солнечного света.

Немаловажную роль в возникновении и распространении инфекций играют плохие санитарно-гигиенические условия тру­да и быта людей, неблагоустроенность населенных пунктов, недо­статочное водоснабжение и плохое качество питьевой воды, от­сутствие ветеринарного надзора и др.