1. Получение нужного гена:

выделение его из ДНК;

химико-ферментативный синтез;

воссоздание на основе изолированной матричной РНК с по­мощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы).

Выделение генов из ДНК.Изолированную ДНК подвергают фрагментации, используя рестрикционные эндонуклеаэы (рестриктазы), катализирующие расщепление ДНК на участках, имеющих определенные последовательности нуклеотидов. В настоящее время известно более 400 рестриктаз, которые узнают 85 различных нук­леотидных последовательностей.

Образующиеся фрагменты нуклеотидной последовательности могут быть:

присоединены к вектору, предварительно обработанному той же рестриктазой;

превращены из линейной молекулы в кольцевую путем сши­вания взаимно комплементарных концов с помощью рестриктаз.

Метод выделения генов из ДНК имеет ряд существенных не­достатков:

трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену;

наряду с интересующим геном фрагменты ДНК, как правило, включают лишние нуклеотидные последовательности, создающие помехи для использования гена;

рестриктаза может отрезать часть нуклеотидной цепочки гена, в результате чего ген теряет функциональную полноценность.

Химико-ферментативный синтез являетсяважной альтернати­вой «вырезанию» генов из нативной ДНК с помощью рестриктаз. Он включает химический синтез коротких (8—16-звенных) одно­цепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтап­ного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшивку олигонуклеотидов между собой посредством ДНК-лигазы с обра­зованием двухцепочечных полинуклеотидов.

Данный метод позволяет точно воссоздать минимально необ­ходимую последовательность нуклеотидов и избежать проблем, связанных с элиминированием лишних нуклеотидных последова­тельностей в фрагментах ДНК. Кроме того, имеется возможность введения в гены участков узнавания различных рестриктаз, регу-ляторных последовательностей и т. п.

Для химико-ферментативного синтеза генов необходимо на­личие полной информации о его нуклеотидной последователь­ности, поэтому использование метода ограничено возможностя­ми получения такой информации. С помощью этого метода созданы гены А- и В-цепей инсулина, проинсулина и др.

Ферментативный синтез генов на основе выделенной из клетки матричной РНК —наиболее популярный метод синтеза генов. Обратная транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной м-РНК. Полученную одноцепочечную ДНК, называемую комплементарной ДНК, используют в качест­ве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы.

Преимущество рассматриваемого метода заключается в том, что, ген получается без интронов (незначащих нуклеотидных по­следовательностей). Кроме того, легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид м-РНК,чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК. Большим успехом в применении этого метода является получение в 1979 году гена гормона роста человека — соматотропина.

2. Введение гена в вектор.Ген, полученный тем или, иным способом, содержит информацию о структуре белка, но сам не может реализовать эту информацию. Нужны дополнительные ме­ханизмы, управляющие действием гена, поэтому перенос гене­тической информации в клетку осуществляется в составе векто­ров.Векторы —это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекрмбинантных ДНК осуществляется invit­ro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Необ­ходимо, чтобы полученная линейная молекула ДНК содержала концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Комплемен­тарные концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой моле­кулы.

Различают два основных класса векторов — вирусы и плазмиды. Важной проблемой, возникающей при использовании виру­сов в качестве генетических векторов, является аттенуация — ос­лабление их патогенности для хозяина, чтобы зараженные ви­русом клетки выживали и могли передать потомству измененную генетическую программу. Большое значение для биотехнологии

имеет способность вирусов быстро транспортироваться из клетки в клетку. Данное свойство открывает возможность генетической модификации соматических клеток взрослого организма. В этом отношении открываются перспективы лечения наследственных заболеваний человека путем введения вирусов, разносящих недо­стающие гены по всем клеткам человеческого организма.

Плазмиды — автономные самореплицирующиеся генетичес­кие единицы. Наибольшее применение в генной инженерии на­шли бактериальные плазмиды (особено плазмиды Eseherichiacoli). Бактериальные плазмиды подразделяются на:

конъюгативиые (переносят генетическую информацию от клет­ки к клетке путем конъюгации бактерий);

неконъюгативные (передаются от одной клетки к другой по­средством механизма бактериальной трансформации).

Перенос неконъюгативных плазмид путем конъюгации воз­можен только в том случае, если существует плазмида-помощник, способная к самостоятельному транспорту. Некоторые плазмиды способны к амплификации, то есть образуют в клетке большое количество копий, что резко повышает уровень фенотипического выражения генов.

При конструировании векторов исследователь вводит в него участки узнавания рестриктаз, а также гены-маркеры, кодирую­щие легко распознаваемые признаки.

Большой интерес представляют космиды — плазмиды, в со­став которых, введен участок ДНК фага А, Е. coli, отвечающий за упаковку ДНК в фаговую частицу. Такие плазмиды способны пе­редавать очень большой объем генетической информации.

3. Перенос генов в клетки организма-реципиента.Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансфор­мации, конъюгации и трансфекции.

Генетический материал, проникающий в клетку, может быть атакован внутриклеточными нуклеазами. В этой связи успешной трансформации способствует:

подавление активности или синтеза нуклеаз;

включение трансформирующей ДНК в липосомы — искус­ственные мембранные липидные везикулы.

Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь передачи генетической информации. Конъюгацию и трансфекцию можно рассматривать как варианты трансформации, осложненной наличием специальных приспособлений для эффек­тивного переноса генов.

4. Идентификация клеток-реципиентов, которые приобрели желаемый ген.После трансформации, конъюгации или трансфек­ции необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. Успех генно-инженерного проекта часто зависит от эффектив­ности использованного метода отбора. Значение этого этапа становится очевидным, если учесть тот факт, что после транспланта­ции генов, как правило, лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.

Первая стадия — отбор клеток, несущих соответствующий вектор. Чаще всего такой отбор проводится по генетическим мар­керам, которыми помечен вектор.

Вторая стадия — поиск клеток, несущих не только вектор, но и ген-мишень. Для этого используются две группы методов.

1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК

клеток-реципиентов:

определение нуклеотидной последовательности ДНК;

гибридизация выделенной из клетки ДНК с зондом, который может быть или интересующим нас геном, или соответствующей м-РНК.

2. Методы, основанные на идентификации признака, кодиру­емого геном:

непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок,—продукт транскрипции и трансляции гена- мишени;

использование селективных бред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень;

иммунологическая детекция.