Генная инженерия и конструирование новых организмов-продуцентов

С помощью методов генной инженерии можно констру­ировать по определенному плану новые формы микроорганизмов, способных синтезировать самые различные вещества, в том числе продукты животного и растительного происхождения. При этом следует учитывать высокую скорость роста и продуктивность мик­роорганизмов, их способность к утилизации различных видов сырья. Широкие перспективы перед биотехнологией открывает возможность микробиологического синтеза белков человека. Та­ким способом были получены соматотропин, интерфероны, инсулин, гормоны роста.

Основные проблемы конструирования новых микроорганизмов-продуцентов сводятся к следующему:продукты генов растительного, животного и человеческого происхождения попадают в чуждую для них внутриклеточную среду, где они подвергаются разрушению микробными протеазами; в большинстве случаев продукт трансплантированного гена не высвобождается в культуральную жидкость и накапливается внутри клетки, что существенно затрудняет его выделение; большинство наследственных признаков кодируется несколь­кими генами, и генно-инженерная разработка должна включать стадии последовательной трансплантации каждого из генов.

Моноклональные антитела

Иммунные сыворотки являются базовыми препарата­ми серотерапии и экстренной профилактики, широко использу­ются в диагностических целях. Вместе с тем, для всех иммунных сывороток характерен существенный недостаток — гетерогенность. Он предопределен тем, что независимо от объекта-донора и спо­соба получения иммунные сыворотки даже при максимальной очистке содержат антитела к различным детерминантам комплек­сного антигена, использованного для иммунизации, антитела раз­личных классов, разные типы L-цепей, неспецифические иммуноглобулины.

Кроме того, гетерогенность сывороток связана с тем, что в им­мунном ответе на комплексный антиген участвует множество кло­нов иммунокомпетентных клеток, синтезирующих антитела раз­личной степени аффинности.

Снятие эффекта гетерогенности иммунных сывороток реаль­но только при получении моноклональных антител, в основу ко­торого положена клональио-селекционная теория Ерне,постули­рующая положение о том, что на каждый компонент комплексного антигена антительно реагирует один клон или отдельная линия лимфоидных клеток. Таким образом, иммунные сыворотки пред­ставляют собой совокупность моноклональных антител.

Сложность получения моноклональных антител состоит в том, что в условиях организма-донора это Недостижимо, а в условиях invitroВ-лимфоциты не размножаются. Решение проблемы было найдено при создании гибридомных технологий (С.Kohler, С,Mil-stein, 1975), в основу которых положен эффект гибридизации, нор­мальных лимфоцитов белых мышей и лимфоцитов этих мышей, больных миеломой.

Полученные таким образом гибридомысочетают основные свойства обеих клеток:

способность нормальных лимфоцитов к синтезу монокло­нальных антител против одной антигенной детерминанты, при­надлежащих к одному классу, подклассу, с одним видом легких цепей и однозначной аффинностью;

способность клетки злокачественной опухоли (плазмоцитомы) безудержно расти и размножаться invitro.

Следует обратить внимание на следующие закономерности получения гибридом:

гомологичность клеток, подвергаемых гибридизации (мышь — мышь, человек—человек);

однотипность функции гибридизируемых клеток (В-лимфо­циты—продукция антител);

сочетаемость нормальных и злокачественных клеток.

Процесс получения гибридом

1. Иммунизация животного соответствующим антигеном, который, как правило, имеет многофакторные антигенные, |.иммуногенные и гаптенные свойства.

2. Через три-четыре дня после иммунизации у мышей из селезенки выделяют субпопуляции В-лимфоцитов, соответственно {реагирующие антителообразованием на каждый компонент комплексного антигена.

3. Выделяют В-лимфоциты, ответственные за продукцию протективно активной части антигена, и суспендируют их с клетками плазмоцитомы миеломных мышей BALB/cпри наличии полиэтиленгликоля (ПЭГ), 1000—4000 в концентрации 35—50 % или в присутствии вируса Сендай. ПЭГ растворяет мембраны клеток,что приводит к появлению гибридов опухолевых клеток и лимфоцитов иммунизированных мышей. Смесь клеток отмывают и инкубируют на среде, содержащей гипоксантин и тимидин. При этом выживают только гибридные клетки.

4. Спустя пять—семь дней среду меняют, а затем через такой же период супернатант растущей культуры проверяют на способность гибридом синтезировать специфические антитела и на активность синтеза. Антиген иммобилизуют на пленках или пластинках и обрабатывают культуральной жидкостью. Эффект соединения антигена и антитела учитывают внесением меченой радиоактивной, ферментной или флюоресцентной метки в составе антиглобулиновой сыворотки.

5. Клонирование. Гибридные клетки переносят на питательную среду, где они размножаются и образуют клон клеток-потомков одной гибридомы.

6. Клонированные гибридомы проверяют на способность синтезировать антитела и на продуктивность. Отобранные гибридомы хранят при минус 70 ºС.

7. Для получения моноклональных антител гибридные клетки размножают путем выращивания на питательных средах или вводя в брюшную полость гистосовместимых мышей, предварительно стимулированных на активизацию роста гибридомных клеток.

Достоинства данного метода:

1. Возможность получения индивидуальных и двойных гибридом. Последние представляют большую ценность для иммунохимических и диагностических исследований.

2. Выраженная масштабность получения. Моноклональные антитела могут быть синтезированы в неограниченном количест­ве против любых антигенных субстанций в титрах 1:10⁸(10 мг антител/мл).

3. Гибридизация позволяет получать Моноклональные анти­тела при иммунизации неочищенным антигеном.

4. Возможность получения моноклональных антител к опухо­левым антигенам с реальной перспективой их использования для лечения злокачественных новообразований.

5. Применение в клинике моноклональных антител для ингибиции субпопуляции Т-лимфоцитов, отторгающих трансплантат.

6. Созданы гибриды миелом мышей и лимфоцитов человека, имеются сообщения о получении человеческих гибридом, в час­тности, к интерлейкину, что позволяет выделять его в очищенном виде.

7. Применение для таксономических целей, изучения бакте­риофагов и борьбы с бактериофагией в условиях микробиологичес­кой промышленности.

8. Возможность получения большого количества функциональ­но иммунокомпетентных клеток и их продуктов.

9. Использование антиидиотипических моноклональных ан­тител в качестве вакцинных препаратов.

Интерфероны

Интерфероны— низкомолекулярные гликопротеины, продуцируемые под влиянием вирусов лейкоцитами, фибробластами и лимфоцитами со свойствами противовирусной, антибластомной и иммуномодулирующей активности.

В зависимости от происхождения различают три типа интерферонов:

алыра-интерферон (лейкоцитарный)получают в культуре лей­коцитов в присутствии вируса Сендай;

бета-интерферон (фибробластный)получают в культуре фибробластов человека;

гамма-интерферон (иммунный)синтезируется стимулирован­ными лимфоцитами при повторной встрече с гомологичным ан­тигеном или под влиянием митогенов.

Иммунорегуляторное действие интерферона проявляется в по­вышении фагоцитарной активности макрофагов, усилении спон­танной активности Т-киллеров и кооперативного иммунного от­вета в отношении вирусиндуцированных опухолевых клеток.

На протяжении более 20 лет интерфероны природного про­исхождения широко используются в клинике для лечения ост­рых и хронических вирусных инфекционных заболеваний, бак­териальных инфекций и некоторых видов злокачественных опухолей.

Однако природным интерферонам, получаемым из клеток млекопитающих, свойственна видоспецифичность. Поэтому ос­новная задача — получение интерферонов из соответствующих клеток человеческого организма — была решена путем использо­вания генной инженерии в условиях микробиологических технологий и применения методов молекулярной гибридизации ДНК и РНК и рестриктазной техники.

С помощью рестриктаз из клеток-продуцентов интерферона выделены соответствующие участки и-РНК, обработкой РНК-за­висимой ДНК-полимеразой созданы комплементарные ДНК; по­лученные гены введены в векторную (плазмидную) ДНК кишеч­ной палочки, к ним присоединены регуляторные элементы, программирующие транскрипцию и трансляцию.

Таким образом, были созданы рекомбинантиые производствен­ные штаммы кишечной палочки, продуцирующие 5 мг интерфе­рона на 1 л бактериальной суспензии. Затем рекомбинантные производственные штаммы-продуценты интерферона были полу­чены из клеток дрожжей и высших эукариотов. К преимуществам последних относится то, что в отличие от прокариотов они про­дуцируют интерферон экзоцеллюлярно, тогда как из прокариотов их выделяют при разрушении микробной клетки.

Иммунотоксины

Иммунотоксины— белковые токсины, ковалентно со­единенные со специфическими антителами, заменяющими роль векторов в молекуле токсина.

|| Иммунотоксины изучаются как препараты с противораковы­ми свойствами и открывают новую главу в борьбе с онкологичес­кими заболеваниями. Наиболее полно экспериментально доказа­но использование в качестве противоракового токсина препарата рицина — белка, выделенного из клещевины. Рицин состоит из двух .субъединиц — А и В,соединенных ковалентно. Противора­ковый эффект достигается следующим образом. Цепь В соединя­ется с поверхностными гликопротеинами клеток и обеспечивает их проницаемость, где в цитоплазме частица А освобождается, ингибирует синтез белка в рибосомах и приводит клетку к гибели. Однако этот эффект не несет противораковой направленности. Последняя достигается тем; что к субъединице А присоединяются в качестве вектора моноклональные противораковые антитела, которые направленно транспортируют этот комплекс к раковой клетке.

Кроме того, иммунотоксины широко используют в трансплан-тологии для предупреждения эффекта отторжения. При трансплан­тации костного мозга моноклональные антитела против Т-лимфоцитов-киллеров донорского костного мозга раздельно конъюгируют с А- и В-цепями рицина, после чего они поглощаются Т-лимфоцитами-киллерами, где спонтанно объединяются в эндосомах и вызывают гибель Т-лимфоцитов.

Искусственные антигены и вакцины

Данный раздел иммунобиотехнологии посвящен раз­работке принципиально новых подходов к созданию вакцин. Суть состоит в том, что из бактериальной клетки выделяют протективные антигенные детерминанты, изучают их структуру, а затем по­лучают синтетическим или генно-инженерным способом. ^

Такие вакцины могут быть моно- и поливалентными, они лишены побочных эффектов, реализуют иммуногенность через продукцию антител, оказывающих нейтрализующее действие на бактерии и вирусы. Существенным преимуществом этих вакцин является их иммуногенная «чистота» и высокая активность за счет соединения с адъювантом.

Предшественником биотехнологических вакцин являются хи­мические вакцины, состоящие из антигенных субстанций микроб­ных клеток, выделенных из культуральной жидкости или экстраги­рованных из массы дезинтегрированных микробных клеток.

В 1980 году во Франции получили генетически сконструиро­ванные клетки бактерий и мышей, способные синтезировать бе­лок вируса гепатита В, который вызывал иммунитет к вирусу. При этом отпадает необходимость в использовании убитых или ослаб­ленных вирусов, отсутствует токсичный или инфекционный ма­териал, который часто загрязняет антиген, полученный из кле­точных структур, а также сокращаются чрезвычайно длительные и дорогостоящие испытания на токсичность.

Рассматривая вопросы профилактики гепатита В, ряд иссле­дователей продемонстрировали оригинальные пути биотехноло­гии вакцин: интеграция геномов вирусов гепатитов в геном ви­руса оспенной вакцины; клонирование вирусной ДНК в клетках Е. coliи ее последующее введение в линии клеток млекопитаю­щих; получение клеток дрожжей, образующих гликолизированный поверхностный антиген.

В 1981—1982 годах, исследователи из французской компании «Трансжен» предприняли попытку заставить генетически скон­струированные клетки Е. coli синтезировать поверхностный бе­лок вируса бешенства. Был выделен клон Е. coli, образующий ви­русный белок с молекулярной массой 58 000 дальтон, ДНК которого ввели в бактерии. Затем синтезировали эту ДНК путем использо­вания в качестве матрицы м-РНК,кодирующую вирусный белок и выделенную из клеток, инфицированных вирусом бешенства.

Проведены попытки синтеза вирусного белка в культурах кле­ток млекопитающих с тем, чтобы улучшить его качества и устано­вить, обладает ли он нужными иммуногенными свойствами.

Возбудителя сифилиса не удается культивировать в искус­ственной среде. Невозможно также получить вакцину против него с помощью общепринятых методов, основанных на экстракции и очистке антигенов. ДНК этой спирохеты была выделена из яичек специально зараженных кроликов, после чего ее клониро­вали в клетках Е. coli с использованием бактериофага в качестве вектора. Отмечено, что один из штаммов генетически конструи­рованных бактерий содержит не менее семи специфических ан­тигенов трепонемы.

Использование техники рекомбинантных ДНК при получе­нии вакцин — еще один шаг на пути разработки их синтетических аналогов. Синтетические вакцины могут заменить имеющиеся, часто содержащие посторонние антигенные детерминанты белки и дру­гие вещества, которые загрязняют основной иммуноген и вызы­вают побочные эффекты.

Впервые об активной иммунизации против дифтерии с ис­пользованием синтетических антигенов было заявлено в 1981 году. Синтетический антиген вызывал у морских свинок образование антител, блокирующих дермонекротическое и летальное действие токсина. Это удалось посредством синтеза тетрадекаптида, ковалентно связанного с двумя различными носителями.

С помощью того же принципа —введением синтетического пептида, соответствующего части белка Streptococcuspyogenes— удалось определить подход к разработке безопасных вакцин про­тив стрептококковой инфекции.;

При получении вирусных вакцин, в том числе против гепати­та В, СПИДа и других, одним из ведущих направлений принято введение в геном вируса оспенной вакцины генов, кодирующих белки, нескольких вирусов, что позволяет получать рекомбинантные вирусы и изготавливать живые противовирусные вакцины.

Рибосомальные вакциныпредставляют собой участки рибосомальной РНК, кодирующей информацию о синтезе иммуногенных веществ. Они обладают относительно низкой токсичностью, в очень малых дозах высокой активностью, способностью защищать от за­ражения родственными микробами и вирусами, усиливают взаи­модействие с рецепторами иммунокомпетентных клеток. Сущест­вуют рибосомальные вакцины из туберкулезной палочки, холерного вибриона, сальмонелл, стрептококка, шигелл.

Получены искусственные антигеныпутем сополимеризации искусственных антигенных детерминант 0-полисахаридов саль­монелл с акриламидом, разработаны подходы к созданию противоаллергических вакцин.

Диагностические и лечебные иммунобиологические препараты

К диагностическим препаратам относятся: флюорес­цирующие и радиоактивно меченные антитела и антигены; белок А-стафилококка; конъюгаты антител и белка А с ферментами.

В тяжелых цепях IgGобнаружены и выделены участки, гомологичные с тимопоэтином, что позволяет использовать их при создании иммунорегуляторных препаратов.

Определена перспектива введения в состав антигенных струк­тур Т- и В-клеток митогенов, интерферона, интерлейкина, спе­цифических антител.

Использование липосомальных лекарственных средств ис­ключает развитие сывороточной болезни, гранулем в месте вве­дения, позволяет существенно повысить специфическую актив­ность включенных препаратов, снизить терапевтические дозы препаратов и предотвратить развитие побочных эффектов.

Липосомы— это ограниченные объемы, возникающие путем самосборки амфифильных дипидных комплексов. Их получают впрыскиванием эфирных растворов фосфолипидов в водный раст­вор или путем смешивания фосфолипидов с детергентами. При образовании липосом водорастворимые вещества включаются во внутренний объем, а жирорастворимые — в фосфолипидные струк­туры. Как лекарственную форму липосомы характеризуют:

возможность включения малорастворимых и токсичных ве­ществ; совокупность биологических свойств, характерных для функ­ций клеточных мембран;

определенная фармакодинамика в организме (векторные свой­ства) с последовательным распределением и накоплением в орга­нах; совместимость с иммунологическими системами организма;

адгезивность и свойство эндоцитоза или прямого слияния с мембранами клеток.

Векторная терапия признана наиболее перспективным направ­лением современной клинической медицины. Усиление исход­ных векторных свойств липосом достигается:

включением в состав их оболочечных структур иммунных в от­ношении возбудителя сывороток и иммуноглобулинов (для направ­ленного воздействия на возбудитель);

введением в липосомы тканевых антигенов (для направлен­ного транспорта липосом в патологический очаг).

Сконструированы иммунолипосомальные комплексы для целенаправленного транспорта лекарственных веществ, иммунотоксинов, разработаны принципы получения антифертильной вак­цины.