Алгоритм лабораторной работы:

1. Разбор схемы постановки ИФА и оценка результатов реакции;

2. Разбор схемы постановки ИХА и оценка результатов реакции;

3. Разбор схемы постановки иммуноблотинга и оценка результатов реакции;

4. Разбор схемы постановки РИФ и РИА и оценка результатов реакции;

5. Разбора схемы постановки ПЦР.

6. Запись схем реакций и выводов в протокол.

7. Оформление протокола.

8. Тестовый контроль и анализ результатов самостоятельной работы каж-дого студента.

Граф логической структуры темы «СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ С МЕТКАМИ. ПЦР».

РИФ

ИХА

ИФА

Электрофорез

Электрофоретическое разделение Аг в полиакрил-

амидном геле

Биообразец (искомый Аг) + специфическая сыворотка, меченная флюорохромом

Биоматериал (сыворотка и др.) помещается в S-зону тест – кассеты для исследуемого образца

В лунках планшета сорбированы Аг (или диагности-ческие Ат)

Добавление Ат, меченных радиоактивным изотопом

S-зон

Перенос пептидов Аг на нитроцеллюлозную мембрану

Ингридиенты:

1. Моноклональные Ат с коллоидным золотом в S-зоне;

2. Фиксированные Ат (или рекомбинантные Аг) в зоне Т (тест);

3. Фиксированные иммунные компоненты в зоне С (контроль)

+ сыворотка больного

Способы отделения Аг+Ат от свободного меченного Аг

1. Гель – фильтрация;

2.Фракционное осаждение иммунного комплекса

Люминисцентная микроскопия

+ радиоактивно меченного конъюгата (или сыворотка против Ig человека, меченная ферментом

+ сыворотка против Ig человека, меченная ферментом (пероксидазой)

Бактерии в мазке светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета

Перенос на рентгеновскую пленку

+ субстрат - хромоген

«+» – результат: две розово (красно) – фиолетовые полосы (в зонах Т и С).

Определение радиоактивности иммунного комплекса по количеству импульсов

Регистрация результата на фотометре (определение оптической плотности)

Радиоавтография: «+» – результат – появление полос (пятен) в месте локализации комплекса Аг + Ат

«-» - результат: одна розово – фиолетовая полоса (в зоне С).

Граф логической структуры темы «Серологические реакции с метками. Пцр».

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Этапы циклов амплификации

Температурный режим в термоциклере

Стадии метода пцр

І. Денатурация – расплетение двухцепочечных молекул ДНК с образованием двух одноцепочечных молекул.

Выделение ДНК возбудителя из биоматериала

t = 93 – 95⁰C

Амплификация ДНК возбудителя в термоциклере «Терцик ДНК – Украина»

ІІ. Отжиг (присоединение праймеров к специфическим участкам ДНК) - происходит в соответствии с правилом комплементарности

t = 54-62⁰C

Детекция ампликонов в агарозном геле методом электрофореза и учет результата в УФ свете трансиллюминатора

ІІІ. Синтез (элонгация) - Таq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК в результате образуется 2 копии ДНК из 1.

t = 72⁰C

7