Методические указания для студентов к практическому занятию №13.
Тема: Дыхание бактерий. Выделение чистых культур анаэробов.
Цель: Изучение методов культивирования анаэробных бактерий.
Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов.
Содержательный модуль 3. Физиология бактерий.
Тема 13: Дыхание бактерий. Выделение чистых культур анаэробов.
Актуальность темы: Рост, размножение, подвижность микроорганизмов осуществляется за счет энергии, которая приобретается бактериями в процессе дыхания. Дыхание (или биологическое окисление) микроорганизмов – это совокупность биохимических процессов, которые сопровождаются выделением энергии, последняя необходима для синтеза различных органических компонентов микробной клетки. Большинство микроорганизмов используют молекулярный кислород воздуха потому, что имеют систему цитохромов, что позволяет им использовать кислород как конечный акцептор водорода. Но Л.Пастером было доказано, что некоторые бактерии не могут развиваться в присутствии кислорода воздуха. Поэтому все микроорганизмы по типу дыхания подразделяют на облигатные аэробы –микроорганизмы, использующие для получения энергии свободный кислород, необходимый в качестве акцептора электронов (атомов водорода), при этом выделяется значительное количество энергии (микобактерии туберкулеза), микроаэрофилы – требуют присутствия минимального количества кислорода (лептоспиры, кампилобактерии), факультативные анаэробы – для получения энергии используют аэробный и анаэробный пути утилизации субстрата (кишечная палочка, сальмонелла брюшного тифа), облигатные анаэробы – могут образовывать АТФ при окислении углеродов, белков и липидов путем субстратного фосфорилирования (клостридии столбняка, ботулизма), капнические бактерии – требуют присутствия CO2.
Дыхание анаэробов происходит путем ферментации субстрата с образованием малого количества энергии. Наличие свободного кислорода для облигатных анаэробов является губительным. Это связано с тем, что в присутствии кислорода конечным продуктом окисления органических соединений является перекись водорода. Поскольку анаэробы не владеют способностью к продукции фермента каталазы, которая расщепляет перекись водорода, то она накапливается и проявляет токсическое действие на бактерии.
Для культивирования анаэробов необходимо создать сниженное парциальное давление кислорода в среде или в воздухе, с которым она сталкивается, что достигается следующими способами:
Физические: анаэростат, аппарат Кипа, кипячение сред;
Механические (добавление к средам редуцирующих веществ): среда Китт-Тароцци, способ Виньяль-Вейона, среда Вильсон-Блера, агар Цейсслера, молоко по Тукаеву, засев уколом в высокий столбик сахарного агара;
Химические: поглощение кислорода в замкнутом пространстве химическим поглощением (раствором пирогаллола) в эксикаторе, аппарат Аристовского, свеча Омельянского;
Биологический: засев Фортнера – аэробный - анаэробный симбиоз бактерий.
Выделение чистых культур анаэробов:
I день – накопление материала. Исследуемый материал засевают на среду Китт-Тароцци, прокипяченную на протяжении 20 минут перед засевом. После засева материала среду нагревают 15 минут при 80 градусах для уничтожения вегетативной флоры; споры анаэробов при этом не погибают. Пробирки с засевами ставят в термостат.
II день – среда мутнеет, иногда в ней появляются пузырьки газа. Делают мазки, окрашивают их по Граму и выявляют крупные споровые и неспоровые грамположительные бациллы.
Выделение чистой культуры анаэробов можно проводит методом Вейнберга или методом Цейсслера.