Методические указания для студентов к практическому занятию № 13.

Тема: Ретровирусы. Вирус иммунодефицита человека.

Цель: Изучение лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции и СПИДа.

Модуль 3. Общая и специальная вирусология.

Содержательный модуль 14. Специальная вирусология.

Тема 13: Ретровирусы. Вирус иммунодефицита человека.

Актуальность темы:Первые ретровирусы были обнаружены в начале XX в. Эллерманном, Бангом и Раусом, установившими вирусную природу эритробластоза и саркомы кур.

Семейство Retroviridae, объединяющее около 150 видов однонитевых РНК-содержащих, обратнотранскрибирующихся вирусов.

Ретровирусы имеют уникальный путь передачи генетической информации. Геном ретровирусов состоит из двух идентичных молекул РНК, т.е. является диплоидным. В составе ретровирусов есть особый вирусоспецифический фермент – обратная транскриптаза или ревертаза, с помощью которой осуществляется процесс обратной транскрипции, т.е. на матрице геномной РНК синтезируется комплементарная однонитевая ДНК (кДНК). Комплементарная нить ДНК копируется с образованием двунитевой комплементарной ДНК, которая интегрирует в клеточный геном и в его составе транскрибируется в иРНК. Синтез белков для этих вирусов осуществляется по схеме:

геномная РНК вируса→комплементарная ДНК→транскрипция иРНК→транскрипция белка вируса.

В самостоятельное семейство они были выделены лишь в 1974 г. В латинском варианте их названия приставка retro(обратный) обозначает обратную направленность потока генетической информации (не от ДНК к РНК, а наоборот, от РНК к ДНК).

Таким образом, ретровирусы плюс-нитевые диплоидные РНК вирусы, содержащие фермент обратную транскриптазу, которая на матрице РНК вируса синтезирует минус-нить ДНК, с которой копируется плюс-нить ДНК с образованием двойной нити ДНК.

Ретровирусы имеют сферическую форму, размер 80-130 нм. Вирион имеет суперкапсид и нуклеокапсидную сердцевину, кубический тип симметрии (капсид икосаэдральный). Типичным является наличие обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы),связанной с геномом – однонитевой плюс-РНК в виде комплекса из двух идентичных субъединиц.

Вирусы содержат протеины: группового антигена (gag), полимеразный протеин (pol) и белки оболочки(env).

Семейство ретровирусов включает 7 родов.

Характеристика ретровирусов (семейство Retroviridae)

Род	Типовой вид и некоторые представители рода
Alphretrovirus	Вирусы лейкоза, саркомы птиц, саркомы рауса кур
Betaretrovirus	Вирус рака молочных желёз мышей, эндогенный ретровирус человека, вирус обезьян Мезон-Пфайзера
Gammaretrovirus	Вирусы саркомы и лейкемии мышей, кошек, приматов
Deltaretrovirus	Вирус лейкемии крупного рогатого скота, лимфотропные вирусы Т-клеток человека (HTLV-1, -2)
Epsilonretrovirus	Вирус саркомы кожи
Spumavirinae	«Пенящие» вирусы, обезьян, бычий cинцитиальный вирус
Lentivirinae	Вирус иммунодефицита человека, вирус Мэди/Висна

Следует отметить, что патогенностью для человека обладает ограниченная группа ретровирусов:

Вирусы	Тип поражения
Т-клеточные лимфотропные вирусы человека (HTLV): HTLV-I	Вызывает Т-клеточные лимфомы и миелопатии (тропи-ческий спастический парапарез)
HTLV-II	Прямых доказательств патогенного действия нет; выделяют при хронических лимфолейкозах.
ВИЧ-1	Вызывает ВИЧ-инфекцию
ВИЧ-2	Близок к ВИЧ-1; также способен вызывать ВИЧ-инфекцию, встречается преимущественно в Западной Африке

ВИРУС ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), или AIDS (от англ, acquired immunodeficiency Syndrome), - тяжелое заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита человека - ВИЧ, или HIV (от англ, human immunodeficiency virus), поражающим преимущественно иммунную систему. Болезнь характеризуется длительным течением, полиморфностью клинических проявлений, высокой летальностью, передается в естественных условиях при половых контактах, а также с кровью при медицинских манипуляциях и способна к быстрому эпидемическому распространению.

ВИЧ открыт в 1983 г. американским ученым Р. Галло и французским исследователем Л. Монтанье одновременно и независимо друг от друга. Большинство исследователей склоняются к мысли об африканском происхождении заболевания и его распространении в США через страны Карибского бассейна, т.к. ещё в начале 70-х гг. у жителей некоторых африканских стран обнаруживали ATк ВИЧ. К настоящему времени идентифицировано два вида ВИЧ.Первый превалирует при клинических формах СПИДа, первоначально обнаружен в Центральной Африке, а позднее и в других регионах. Второй преимущественно выделяют в Западной и Центральной Африке. ВИЧ-2 проявляет более низкую вирулентность. После открытия Гэлло вирус относили к лимфотропным Т-клеточным ретровирусам; но более поздние исследования выявили имеющиеся существенные отличия.

Таксономия.ВИЧ отнесен к семейству Retroviridae, подсемейству Lentivirinae.

Морфология и культивирование.ВИЧ - сравнительно просто устроенный РНК-содержащий вирус, имеет сферическую форму, размер около 100 нм. Двуслойная липидная оболочка пронизана гликопротеидными антигенами gp120 и gp41 (домены gpl60). Сердцевина вируса имеет конусовидную форму и состоит из капсидных белков р24 и р25, матриксных белков, и белков протеаз. РНК - двухспиральная, для осуществления процесса репродукции ВИЧ имеет обратную транскриптазу или ревертазу (она же РНК-зависимая ДНК-полимераза). Вирус очень трудно культивируется в искусственных условиях, размножается только в культурах лимфоцитов, накопление невысокое.

Стадии взаимодействия ВИЧ с клеткой-мишенью:

1. Связывание вириона с поверхностью клетки. Резекция вируса.

2. Слияние мембраны вируса и клетки. Проникновение вируса.

3. Высвобождение нуклеотида и геномной РНК-вируса.

4. Синтез провирусной ДНК на матрице геномной РНК-вируса.

5. Интеграция генома провируса в геном клетки.

6. Латентный период, в течении которого ДНК-провируса интегрировано в геном.

7. Активация процесса транскрипции с ДНК провируса, трансляция белков вируса.

8. Активная репликация вируса, т.е. продукция всех компонентов вируса и формирование из них зрелых дочерних вирионов.

9. Высвобождение вирионов и отдельных белков ВИЧ из клетки хозяина во внешнюю среду и беспрепятственное заражение других клеток. Цитопатогенные инфекции ВИЧ.

Антигенная структура.ВИЧ имеет ряд поверхностных (gp160, gp120, gp41) и сердцевинных (р24, р18 и др.) антигенов, определяющих его серологические свойства. В настоящее время выделяют две антигенные разновидности вируса: ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Основные антигены вызывают образование антител у инфицированных людей; вначале появляются антитела к gp120, gp41, затем р24, которые длительно сохраняются в крови.

ВИЧ обладает уникальной антигенной изменчивостью, которая в сотни и тысячи раз превосходит изменчивость вируса гриппа, благодаря тому, что скорость его транскрипции значительно выше, чем у других вирусов. Это затрудняет диагностику и специфическую профилактику ВИЧ-инфекции.

Факторы патогенности.ВИЧ обладает лимфотропностью благодаря тому, что на лимфоцитах Т-хелперах существуют в норме рецепторы CD-4, имеющие сродство к белку gp120 вируса. Это создает благоприятные условия для прикрепления вируса к лимфоцитам, проникновения их в клетку и последующего размножения в лимфоците. В результате размножения ВИЧ в лимфоцитах последние разрушаются и погибают или снижают свою функциональную активность. Однако ВИЧ поражает не только Т4-лимфоциты, но и другие клетки (нервные, В-лимфоциты, макрофаги, клетки Лангерганса), которые имеют рецепторы типа CD-4, как у Т-лимфоцитов. Поражение иммунных и других клеток приводит к снижению защитных функций иммунной системы, развитию иммунодефицитного состояния и проявлению в результате этого вторичных заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.

Культивирование.Культивируется ВИЧ на культуре клеток Т-лимфоцитов и моноцитов человека, но для этого требуется присутствие интерлейкина-2 (ИЛ-2).

Резистентность.ВИЧ сравнительно малоустойчив в окружающей среде, а также к физическим и химическим факторам. При комнатной температуре сохраняется до 4 сут; через 5-10 мин инактивируется после обработки спиртом, эфиром, гипохлоритом, быстро гибнет при действии моющих средств, губительна солнечная радиация, искусственное УФ излучение, ионизирующая радиация.. Кипячение быстро убивает вирус, прогревание до 80⁰С обезвреживает его в течение 6-7 мин, а до 60⁰С - в течение 30 мин.

Имеются данные, что ВИЧ теряет активность при воздействии ферментов слюны и пота. Однако вирус может длительно (до 2 недель) сохраняться в высушенном состоянии, в высохшей крови, а в донорской крови может сохраняться годами.

Восприимчивость животных.К ВИЧ чувствителен только человек; отдельные проявления ВИЧ-инфекции можно вызывать лишь у обезьян шимпанзе, у которых, однако, симптоматика СПИДа не развивается.

Эпидемиология.ВИЧ-инфекция впервые зарегистрирована в 1980-1981 гг. в США среди гомосексуалистов, затем среди лиц, страдающих гемофилией, которым для лечения часто проводят переливания крови, а впоследствии среди наркоманов и проституток.Источником инфекцииявляются только больной человек и носитель ВИЧ. Заражение происходит при половом контакте и парентеральном введении ВИЧ-инфицированных материалов (кровь, сыворотка, плазма, препараты крови), а также использование нестерильных инструментов и приборов, загрязненных кровью больных (шприцы, иглы, системы для переливания крови и т. д.). Возможно внутриутробное инфицирование плода, а также инфицирование ребенка через молоко ВИЧ-инфицированной матери. При бытовых контактах и через кровососущих насекомых вирус не передается.

ВИЧ-инфекция распространена на всех континентах в подавляющем большинстве стран, особенно в Америке, Африке и Европе. Эпидемия ВИЧ-инфекции стремительно распространяется; число больных удваивается через каждые 8-10 мес и за 15 лет достигло нескольких миллионов при 20 млн носителей. ВИЧ-инфекция отнесена к кризисным инфекциям, угрожающим существованию человечества, поэтому ВОЗ разработала меры по ограничению его распространения. Принят закон по борьбе с ВИЧ-инфекцией и в России.

Вирус попадает в кровь при половых контактах (особенно извращенных) или указанных выше медицинских манипуляциях, проникает в клетки, размножается в них, выходит из клеток и распространяется по всему организму. Его можно обнаружить в крови, лимфе, слюне, слезах, сперме, отделяемом влагалища, коже и других жидкостях и клетках.

Патогенез.Проникая в кроветворное русло, ВИЧ инфицирует Т-хелперы и другие клетки на поверхности которых в норме существуют рецепторыCD4 , имеющие сродство к белкуgp120 ВИЧ.

Вирус прикрепляется к Т-лимфоциту, проникает путем эндоцитоза и репродуцируется в лимфоцита. В результате размножения ВИЧ в лимфоците последние разрушаются и теряют свои функциональные свойства.

ВИЧ инфицирует также моноциты, макрофаги, В-лимфоциты, клетки Лангерганса, дентритные нервные клетки и другие, которые имеют рецепторы CD4 как у Т-лимфоцитов.

В результате размножения вируса в различных клетках происходит накопление его органах и тканях, и он обнаруживается в крови, лимфе, слюне, сперме, слезах, моче, поте, каловых массах, содержимом урогенитального тракта, грудном молоке, в гное при воспалительных процессах.

При ВИЧ-инфекции снижается число Т₄-лимфоцитов, а также отношение Т₄/Т₈, нарушается функция В-лимфоцитов, снижается и нарушается продукция комплемента, интерлейкинов, интерферона, в результате чего наступает дисфункция иммунной системы и расстройство ее деятельности. Вследствие поликлональной активации В-лимфоцитов вирусом возможно повышение уровня иммуноглобулинов. В результате иммунодепрессии, подавления клеточного и гуморального звена иммунитета организм становится беззащитным против экзогенных (бактерии, вирусы, грибы, простейшие) и эндогенных (опухолевые и другие клетки) антигенов. Этот механизм лежит в основе возникновения вторичных болезней и клинических проявлений ВИЧ-инфекции.

Клиника.ВИЧ-инфекция, по акад. В. И. Покровскому с 1989 года, характеризуется несколькими стадиями:

I. Стадия инкубации.

Установлено, что инкубационный период(от момента инфицирования до первых клинических проявлений или сероконверсии) продолжается от 2—3 нед до 1—2 мес, а по некоторым данным и до 3—5 лет.

II. Стадия первичных проявлений:

А — острая лихорадочная фаза;

Б — бессимптомная фаза;

В — персистирующая генерализованная лимфаденопатия.

Однако в крови определяются ВИЧ-антитела. Эта стадия может длиться годами (10-15 лет). В этот период защитные системы организма сдерживают репродукцию возбудителя.

III. Стадия вторичных заболеваний:

А — потеря массы тела менее 10%; поверхностные грибковые, вирусные, бактериальные поражения кожи и слизистых оболочек; опоясывающий лишай; повторные фарингиты, синуситы;

Б — прогрессирующая потеря массы тела более 10%; необъяснимая диарея или лихорадка более 1 мес; волосатая лейкоплакия; туберкулез легких; повторные или стойкие бактериальные, вирусные, грибковые, протозойные поражения внутренних органов (без диссеминации) или глубокие поражения кожи и слизистых оболочек; повторный или диссеминированный опоясывающий лишай; локализованная саркома Капоши;

В — генерализованные бактериальные, вирусные, грибковые, протозойные, паразитарные заболевания; пневмоцистная пневмония; кандидоз пищевода; внелегочный и атипичный туберкулез; кахексия; диссеминированная саркома Капоши; поражения ЦНС различной этиологии.

IV. Терминальная стадия: развиваются кахексия (резкое уменьшение массы тела), адинамия, деменция (слабоумие) и другие явления при снижении всех иммунологических показателей.

Считают, что только терминальную стадию можно относить к собственно СПИДу, все предыдущие следует трактовать как ВИЧ-инфекцию.

Летальность при СПИДе достигает 100 %.

Для людей, пораженных ВИЧ-инфекцией, характерны 3 группы заболеваний – оппортунистические инфекции, опухолевые болезни и поражение ЦНС.

Средняя продолжительность жизни инфицированного человека примерно 7-15 лет.

Иммунитет.Иммунитет носит гуморальный и клеточный характер. Роль антител недостаточно выяснена.

Лабораторная диагностика.Вирусологическая и серологическая диагностика сводится к определению в жидкостях и тканях организма (сыворотка крови, лимфоциты, макрофаги, сперма, слюна, содержимое влагалища и др.) вируса или его антигенов, а также антител к ВИЧ в сыворотке крови. Вирус выделяют в культуре клеток лимфоцитов, что довольно трудно в обычных условиях. Антитела к ВИЧ определяют в основном с помощью ИФА, подтверждая положительные результаты, используя метод иммуноблоттинга.

Наличие ВИЧ в крови можно выявить в различные сроки, обычно одновременно с появлением белка р24. Растворимый р24 антиген может быть выявлен в кровотоке не ранее чем через 5-10 суток после заражения. Вирусемия достигает пика к 10-20 суткам после заражения и продолжается до появления специфических антител. В крови больного появляются вируснейтрализующие антитела против gp120 иgp41, р24. ВИЧ антитела появляются через 2-4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ-инфекции и при СПИДе.

В настоящее время наиболее чувствительными и специфичными признаны ИФА и метод вестернблота.

Выявить ВИЧ-инфекцию, т.е. вирус, в инкубационном и раннем клиническом периоде можно при помощи ПЦР.

С помощью ИФА определяют антитела к белкам gp41,gp120,p24.

В связи с тем, что gp120 имеет структурное и антигенное сходство с рецепторами некоторых клеток человека, в организме могут появляться антитела, родственные антителам противgp120. В этом случае могут быть ложноположительные результаты ИФА. Поэтому все положительно реагирующие сыворотки исследуемых подвергаются дополнительному анализу с помощью метода иммуноблотинга или вестернблотинга. В основе этого метода лежит идентификация исследуемых антител после электрофоретического разделения их и последующего тестирования с помощью меченых антивидовых антител. Метод вестернблот позволяет обнаружить специфические антитела в сыворотке к р24,gp41 либоgp120.

Клинический и серологический диагнозы подтверждаются иммунологическими исследованиями, если они указывают на наличие иммунодефицита у обследуемого пациента.

Лечение.Лечение неэффективно. Некоторые результаты дает применение азидотимидина, подавляющего репликацию вируса в клетке.

Препараты, используемые для лечения ВИЧ инфицированных пациентов, разделены согласно их действию на различные стадии репликации ВИЧ:

1. Препараты, ингибирующие обратную транскриптазу: азидотимидин, ставудин.

Лечение азидотимидином продолжает жизнь больным ВИЧ-инфекцией в среднем на 1,5-2 года. Фосфазид – отечественный препарат, более эффективен и менее токсичен, чем азидотимидин.

2. Препараты, ингибирующие протеазы: саквиновир, ритонавир и др.

Основная перспектива их терапевтического использования – совместное применение с ингибиторами обратной транскриптазы.

3. Комбинированная терапия: ингибиторами обратной транскриптазы и ингибиторами протеаз.

Профилактика.Специфическая профилактика не разработана.

В течение длительного времени предпринимаются попутки разработать вакцину против ВИЧ, однако надежной и безопасной вакцины против ВИЧ не существует. Созданы вакцины на основе методов генной инженерии. Решение вопроса об эффективности этих вакцин требует значительного времени.

Основные меры борьбы сводятся к пресечению возможностей инфицирования при половых контактах (механические способы защиты), борьбе с проституцией, наркоманией и гомосексуализмом; исключению условий передачи ВИЧ при медицинских манипуляциях (одноразовые шприцы, иглы, системы для переливания крови, проверка доноров и препаратов крови на ВИЧ и т. д.); санитарно-просветительной работе. С целью ограничения распространения ВИЧ-инфекции Минздравом утверждены соответствующие правила медицинского освидетельствования на выявление заражения вирусом иммунодефицита человека, регламентирующие комплекс профилактических мероприятий по борьбе с этой чрезвычайно опасной болезнью.

Конкретне цели:

1. Знать эпидемиологическую ситуацию на заболеваемость ВИЧ в Украине.

2. Знать классификацию ретровирусов и патогенных для человека представителей рода Lentivirus.

3. Объяснить почему вирусы называются ретровирусами.

4. Изучить пути передачи ВИЧ-инфекции и ее патогенез.

5. Ознакомиться с методами лабораторной диагностики и научиться трактовать результаты исследования.

6. Выучить препараты для лечения ВИЧ-инфекции.

Уметь:

1. Проводить отбор материала для лабораторных исследований в соответствии со стадией заболевания ВИЧ/СПИД.

2. Правильно оценивать результаты методов лабораторной диагностики и делать выводы.

Теоретические вопросы:

1. Классификация ретровирусов.

2. Особенности строения ВИЧ. Антигенная структура.

3. Группы риска, пути заражения и патогенез ВИЧ-инфекции.

4. Клетки-мишени ВИЧ, механизм иммуно-супрессивного действия ВИЧ.

5. Стадии ВИЧ-инфекции. ВИЧ-ассоциированные инфекции.

6. Особенности иммунитета.

7. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции и СПИДа.

8. Перспективы иммунопрофилактики ВИЧ-инфекции.

9. Этиотропная терапия, механизм действия антиретровирусных препаратов.

Практические задания, выполняемые на занятии:

1. Зарисовка в протокол структуры ВИЧ.

2. Изучение по таблице метода ИФА.

3. Ознакомление с лабораторией и аппаратурой для постановки ИФА.

4. Оформление протокола.

Литература:

1. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією.– Київ.: Вища шк., 1992.– 431с.

2. Воробьев А.В., Биков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология.– М.: Медицина, 1998.– 336с.

3. Медицинская микробиология /Под ред. В.И. Покровского.– М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.– 768с.

4. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, Санкт–Петербург «Специальная литература», 1998.– 592 с.

5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.– 2-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1983,- 512с.

6. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

1. Тiтов М.В. Iнфекцiйнi хвороби.- К., 1995.– 321с.

2. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.- М.: Медицина, 1990.- 559 с.

3. БМЭ.- Т. 1, 2, 7.

4. Гайдаш І.С., Флегонтова В.В. Медична вірологія.– Луганськ, 2002.– 357 с.

Короткие методические указания к практическому занятию:

В начале занятия проводится проверка уровня знаний студентов по теме.

Самостоятельная работа состоит из изучения структуры вируса по рисункам, слайдам и зарисовки ее в протокол. Дальше студенты знакомятся с лабораторией и аппаратурой для ИФА, по таблицам изучают иммуноферментный метод диагностики.

В конце занятия проводится тестовый контроль и анализ итоговых результатов самостоятельной работы каждого студента.