Методическое указание для студентов к практическому занятию № 19
Тема: Иммунные сыворотки. Реакция нейтрализации.
Титрование антитоксических сывороток.
Цель: Изучение иммунобиологических препаратов, которые используют с
лечебной, профилактической и диагностической целью.
Освоение методики постановки реакции флокуляции для титрования
антитоксических сывороток.
Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция.
Иммунитет.
Содержательный модуль 9. Реакции иммунитета. Иммунопатология.
Тема занятия № 19. Иммунные сыворотки. Реакция нейтрализации.
Титрование антитоксической сыворотки.
Актуальность темы. Иммунные сыворотки - это иммунобиологические препараты, содержащие готовые антитела, которые имеют способность нейтрализовать действие патогенных микроорганизмов и продукты их жизнедеятельности. Иммунные сыворотки используют с лечебной, профилактической (для получения пассивного иммунитета) и диагностической целью.
Иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, получают путем многократной иммунизации (гипериммунизации) лошадей. В начале, животным подкожно вводят небольшие дозы антигена, которые постепенно увеличивают. Иммунизацию прекращают после того, как животные перестает реагировать увеличением титра антител на повторное введение антигена.
После прекращения иммунизации (через 10-12 дней) проводят кровопускание. Из крови получают сыворотку. Для удаления балластных белков (которые имеют токсичное и аллергическое действие) разработанные методы очищения сывороток с помощью сульфата аммония, электрофореза, ферментативного гидролиза и др.
Иммунные сыворотки, полученные из крови животных, называют гетеро-логичными, а из крови людей - гомологичными. По направленности действия сыворотки разделяют на антитоксические (противодифтерийная, противостолбнячная, противоботулинованя и др.), антибактериальные и противовирусные (иммуноглобулины).
Антитоксические сыворотки выпускают с определенным содержанием антитоксинов, силу которых измеряют в международных единицах (МО) или в антитоксических единицах (АЕ). Для определения силы действия антитоксических сывороток используют феномен флокуляции.
Титрование антитоксических сывороток проводят двумя методами: по Рамону и по Эрлиху.
Иммуноглобулины получают из донорской, плацентарной или абортивной крови человека, а также из сывороток гипериммунизированных животных. Иммуноглобулины человека менее реактогенны, а потому максимально безвредны; после введения циркулируют дольше гетерологичных ( 4-5 недель). Существует два вида иммуноглобулинов - нормальный (или противокоревой) и иммуноглобулины направленного действия (противогриппозный, антирабический и др.).
При введении сывороток могут возникать аллергические реакции, такие как гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ). ГНТ обусловлена взаимодействием аллергена с IgЕ, которой сорбирован на мембранах тучных клеток и базофилов, что приводит к высвобождению гистамина, серотонина, эозинофильных и базофильных хемотаксических факторов и протеаз. Медиаторы взаимодействуют с рецепторами мышечных, секреторных и других клеток, что ведет к сокращению гладкой мускулатуры, проницаемости сосудов и отеку.
Для предупреждения анафилактических реакций сыворотки вводят дробно по методу Безредко.
Сывороточная болезнь развивается через 8-12 суток после введения сыворотки и обусловленная образованием иммунных комплексов, которые фиксируются в тканях. В норме комплексы АГ-АТ элиминируются фагоцитами. Когда комплексы удержатся в тканях, то они вызывают реакции воспаления. Макрофаги и нейтрофилы выделяют протеолитические ферменты и другие медиаторы воспаления, которые и повреждают ткани.
Диагностические сыворотки используют в серологических реакциях для определения неизвестного антигена.
В настоящее время широко используют моноклональные антитела, т.е. те антитела, которые синтезируются одним клоном антителообразующих клеток, т.е. клеток, которые возникли с одного и того же зрелого В-лимфоцита. Они узнают только один антиген и взаимодействуют только с ним. Возникновение в организме моноклональних антител было выявлено при развитии лимфоидных опухолей (плазмоцидом). В этом случае в организме больного происходит размножение одного клона лимфоцитов. Искусственное получение клеток-продуцентов моноклональних антител стало возможным после разработки методики получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридома - это гибрид нормальной антителообразующей и опухолевой клеток. Такой гибрид унаследовал от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой - бессмертие и способность к неограниченному росту.
В 1975 году Г.Келер и К. Мильштейн осуществили слияние лимфоцитов селезенки мыши, иммунизированной бараньими эритроцитами, с культивированными клетками миеломи и определили, что некоторые гибридомы секретируют антитела к бараньим эритроцитам. Для получения гибридом были использованные такие штаммы миеломних клеток, которые не содержат фермент гипоксантинфосфорибозилтрансферази и поэтому гибнут в селективной среде - ГАТ (содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин); лимфоциты в такой среда не гибнут. Возникающие при слиянии клеток гибридомы наследуют от В-лимфоцитов способность к синтезу специфических иммуноглобулинов и способность размножаться в селективной среде ГАТ, а от миеломной клетки - способность к бесконечному размножению.
Процесс получения гибридом включает следующие стадии:
-
получение линии миеломных клеток. Чаще с этой целью применяют мышиные или крысиные клеточные линии;
-
получение иммунных В-лимфоцитов (антителообразующих клеток) из селезенки иммунизированных соответствующим антигеном животных;
-
выделение гибридом и отбор из них интересующего клона;
-
накопление клеток полученного клона для его практического использования.
Преимуществом гибридом является то, что с их помощью возможно получение неограниченного количества антител, которые сохраняют свою специфичность и чувствительность.
Моноклональные антитела широко используют для определения белков крови и других биологических жидкостей, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и иммунитета, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов и др. Моноклональные антитела, благодаря своей высокой специфичности, стандартности и технологичности получения вытесняют и заменяют иммунные сыворотки.
Конкретные цели:
-
Ознакомление с этапами получения антитоксических сывороток в производственных условиях.
-
Ознакомление с принципами и стадиями получения гаммаглобулинов.
-
Ознакомление с принципами постановки реакции нейтрализации и титрованием антитоксических сывороток.
-
Ознакомление с механизмом аллергических реакций и сывороточной болезни, которые возникают на введение сывороток.
Уметь:
-
Проводить реакцию нейтрализации.
-
Проводить расчет титра сыворотки в поставленном опыте.
Теоретические вопросы:
-
Классификация иммунных сывороток.
-
Лечебные и профилактические сыворотки и их применение.
-
Диагностические сыворотки и их применение в серологических реакциях.
-
Получение иммунных сывороток от животных и людей.
-
Получение гаммаглобулинов.
-
Антитоксины. Механизм их действия.
-
Титрование антитоксических сывороток.
-
Классификация реакций гиперчуствительности.
-
Осложнения, которые могут возникать при введении иммунных сывороток. Механизм их возникновения.
-
Получение моноклональних антител.
Практические задачи, которые выполняются на занятии:
-
Постановка реакции флокуляции для титрования антитоксической сыворотки (дифтерийной) по схеме.
-
Учет реакции.
-
Оформление протокола (запись схемы постановки реакции и вычисление титра сыворотки).
Дополнительная литература:
-
Воробьев А.В., Биков А.С., Пашков Э.П., Рыбакова А.М. Микробиология.- М.: Медицина, 1998.- 336с.
-
Попов М.М., Циганенко А.Я., Мінухін В.В. Основы иммунологии: Учебник.- Харьков: Вид-во “Основа”, 2005.- 276с.
-
Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Микробиология с вирусологией и иммунологией.- Киев.: Высшая шк., 1992.- 431с.
-
Медицинская микробиология /Под ред. В.И. Покровского.- М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.- 768с.
-
Конспект лекции.
Короткие методические указания к работе на практическом занятии:
В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию.
Самостоятельная работа состоит из проведения реакции нейтрализации для определения титра антитоксической сыворотки по Рамону. Для этого в пробирках (in vitro) используют токсин и сыворотку, которая содержит антитела к этому токсину. При их смешивании образуется легкое помутнение, потом появляется мелкая взвесь, которая в конце оседает на дно пробирки. Осадок называется флокулянт, поэтому реакция называется реакция флокуляции. Помутнение, прежде всего, появляется в того пробирке, где количество токсина эквивалентно количеству антител. Эта особенность была использована в производстве антитоксических сывороток для определения количества антитоксических (международных) единиц в 1 мл изготовленной сыворотки.
За 1 МЕ принимают то наименьшее количество сыворотки, которая может нейтрализовать 100 смертельных доз токсина (100 Dlm).
Методика постановки реакции:
-
в стерильные сухие пробирки наливают по 2 мл токсина;
-
в первую пробирку вносят 0,1 мл сыворотки, в другую - 0,2 мл, в третью - 0,3 мл и так дальше;
-
пробирки ставят в термостат на 1 час при температуре 37°С.
-
проводят оценивание реакции по помутнению. В той пробирке, где помутнения появится раньше за все и находится 1 МЕ.
В конце лабораторной работы студенты проводят анализ результатов реакции и вносят их в протокол.