- •Методические указания для студентов к практическому занятию № 2.
- •Тема 2: Лабораторная диагностика гриппа.
- •Вирусы гриппа и других острых респираторных заболеваний
- •Вирусы гриппа
- •Краткие методические указания к работе на практическом занятии.
- •Технологическая карта проведения практического занятия
- •Целевые обучающие задания:
- •А. Субединичная вакцина
- •А. Ремантадин
- •А. Гемагглютинин и нейраминидаза
- •Алгоритм лабораторной работы:
- •Граф логической структуры темы «лабораторная диагностика респираторных инфекций» Мазки, смывы из носоглотки, мокрота и др. Парные сыворотки крови
Методические указания для студентов к практическому занятию № 2.
Тема: Лабораторная диагностика гриппа и ОРЗ.
Цель: Изучение лабораторной диагностики гриппа и ОРЗ.
Модуль 3. Общая и специальная вирусология.
Содержательный модуль 16. Специальная вирусология.
Тема 2: Лабораторная диагностика гриппа.
Актуальность темы: В настоящее время грипп является наиболее распространенной инфекцией на земном шаре и регистрируется на всех континентах. Особенностью этой инфекции является быстрота распространения. При эпидемических вспышках болеет до 30-50% населения пораженного региона, что приводит к значительным экономическим затратам. Так грипп остается не контролируемой инфекцией. Во время эпидемии страдают пожилые и ослабленные люди, особенно те, которые имеют хронические заболевания сердца, легких, а также дети, увеличивается количество смертей от сердечно-сосудистых, легочных заболеваний.
Выявлены в последние годы новые свойства возбудителя гриппа – способность обмениваться генетической информацией с возбудителями гриппа животных и птиц, длительное время сохраняться в организме человека после выздоровления и даже, как считают, может быть одним из возможных факторов развития у человека медленных инфекций. Все это усиливает значимость этой проблемы и необходимость дальнейшего изучения возбудителя гриппа.
Вирусы гриппа и других острых респираторных заболеваний
Группа острых респираторных (от лат. respiratio - дыхание) вирусных инфекций (ОРВИ) включает большое количество наиболее распространенных болезней, характеризующихся поражением различных отделов дыхательных путей и аэрогенным механизмом передачи.
ОРВИ могут вызывать более 200 вирусов: вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синтициальный вирус, риновирусы, коронавирусы, реовирусы, аденовирусы, некоторые серотипы вирусов Коксаки и ECHO. Все эти вирусы принадлежат к разным семействам и родам, отличаются между собой по биологическим свойствам и поэтому требуют индивидуального подхода при проведении лабораторных исследований.
Наибольшее значение в патологии человека имеют вирусы гриппа. Среди других вирусов - возбудителей ОРВИ - наибольший удельный вес занимают риновирусы и коронавирусы; вирусы парагриппа и респираторно-синцитиальный вирус могут вызывать тяжелые воспалительные заболевания нижних отделов дыхательных путей.
Вирусы гриппа
Грипп - острое респираторное заболевание, характеризующееся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, лихорадкой, симптомами общей интоксикации, нарушением деятельности сердечно-сосудистой и нервной систем. Грипп отличается склонностью к эпидемическому и пандемическому распространению благодаря высокой контагиозности и изменчивости возбудителя.
В 1933 г. У. Смит, К. Эндрюс и П. Лейдлоу от больных гриппом выделили вирус, названный впоследствии вирусом гриппа типа А. В 1940 г. были открыты вирусы гриппа типа В, а в 1947 г. - типа С. В России первые вирусы гриппа были выделены в 1936 г. А. А. Смородинцевым и отнесены к типу А.
Таксономия, классификация. РНК-содержащие вирусы относятся к семейству Orthomyxoviridae (от греч. orthos - правильный, myxa - слизь). Семейство включает два рода: род Influenzavirus объединяет вирусы гриппа типов А и В, род Influenza С представлен вирусом гриппа типа С.
Морфология и химический состав. Вирионы имеют сферическую форму диаметром 80-120 нм, реже палочковидную и нитевидную; состоят из сердцевины и наружной липопротеидной оболочки. Сердцевина содержит однонитчатую линейную фрагментированную минус-нитевую РНК, белковый капсид, окруженный дополнительной мембраной - слоем матриксного белка. Нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии. На поверхности суперкапсидной оболочки имеются шипы гликопротеидной природы, одни из которых являются гемагглютинином, другие - нейраминидазой.
Культивирование. Для культивирования используют куриные эмбрионы, культуры клеток, иногда лабораторных животных.
Антигенная структура. Вирусы гриппа имеют внутренние и поверхностные антигены. Внутренние сердцевидные антигены являются типоспецифическими, на основании чего вирусы гриппа подразделяются на типы А, В и С, поверхностные представлены гемагглютинином (Н) и нейраминидазой (N). Н - основной специфический антиген, вызывающий образование вирус-нейтрализующих антител и обеспечивающий адсорбцию вируса на клетках, в том числе эритроцитах человека или животных, в результате чего происходит их склеивание (гемагглютинация). N вызывает образование антител, частично нейтрализующих вирусы; являясь ферментом, N участвует в освобождении вирусов из клетки.
Характерной особенностью вирусов гриппа, в основном типа А, является изменчивость антигенов Н и N. Известны три разновидности Н и две разновидности N. В зависимости от их сочетания выделяют три подтипа вируса гриппа А человека: H1N1, H2N2, H3N2, соответственно A1, A2, A3. Внутри подтипов имеется множество антигенных вариантов, отличающихся по структуре Н- и N-антигенов.
Изменчивость поверхностных антигенов связана с фрагментарным строением РНК вируса и может происходить в виде дрейфа и шифта. Дрейф - постоянно осуществляющиеся незначительные изменения Н- и N-антигенов в результате точечных мутаций, приводящие к возникновению новых антигенных вариантов вируса. Шифт (скачок) - редко встречающиеся значительные изменения Н- и N-антигенов в результате рекомбинаций, приводящие к появлению новых подтипов вируса.
По сравнению с вирусами гриппа типа А антигенная структура вирусов гриппа типа В изменяется только по типу дрейфа, а тип С не имеет N-антигена и мало изменчив.
Резистентность. В воздухе вирусы гриппа могут сохранять инфекционные свойства при комнатной температуре в течение нескольких часов; чем выше температура и относительная влажность воздуха, тем быстрее инактивируются вирусы. Возбудители гриппа чувствительны к действию УФ-лучей, многим дезинфицирующим средствам (формалину, этиловому спирту, фенолу, хлорамину), жирорастворителям; в жидкой среде инактивируются при температуре 50-600С в течение нескольких минут. Длительное время сохраняются в замороженном состоянии и в глицерине.
Восприимчивость животных. В естественных условиях вирусы гриппа типа А поражают как человека, так и животных; вирусы типов В и С . только человека. Среди лабораторных животных к вирусам гриппа чувствительны африканские хорьки, сирийские хомяки, белые мыши. Заболевание характеризуется поражением легких и нередко заканчивается гибелью животных.
Эпидемиология. Из всех острых респираторных вирусных инфекций грипп является наиболее массовым и тяжелым заболеванием. Пандемии и эпидемии гриппа охватывают до 30-50 % населения земного шара и более, нанося огромный ущерб здоровью людей и экономике стран. Так, пандемия гриппа «испанки», вызванная вирусом A (H1N1) в 1918-1920 гг., охватила около 1,5 млрд человек и унесла более 20 млн жизней. Восприимчивость людей к гриппу высокая. Болеют все возрастное группы населения, преимущественно в зимнее время года.
Возникновение пандемий и крупных эпидемий обычно связано с появлением нового подтипа вируса гриппа А. Ежегодные эпидемические вспышки вызываются новыми антигенными вариантами одного подтипа. В последние годы эпидемии гриппа связаны с вирусом гриппа A (H3N2), хотя среди населения продолжают циркулировать вирусы гриппа A (H1N1) и В.
Источником гриппозной инфекции является больной человек с клинически выраженной или бессимптомной формой. Путь передачи - воздушно-капельный (при разговоре, кашле, чиханье).
Патогенез и клиническая картина. Вирусы гриппа внедряются и репродуцируются в эпителиальных клетках слизистой оболочки верхних дыхательных путей, откуда проникают в кровь и разносятся по всему организму. Продукты распада поврежденных клеток и некоторые вирусные белки оказывают токсическое действие на различные органы и системы организма.
Инкубационный период короткий - от нескольких часов до 1-2 сут. Для гриппа характерны острое начало, высокая температура тела, общая интоксикация, выражающаяся в недомогании, головной боли, боли в глазных яблоках, поражение дыхательных путей различной степени тяжести. Лихорадочное состояние при гриппе без осложнений продолжается не более 5-6 дней. Тяжесть и исход болезни нередко связаны с осложнениями, вызванными самим вирусом гриппа (гриппозная пневмония, острый отек легких) или условно-патогенными бактериями. Развитию осложнений способствует угнетающее действие вирусов гриппа на процессы кроветворения и иммунную систему организма.
Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется стойкий типо-, подтипе- и вариантоспецифический иммунитет, который обеспечивается клеточными и гуморальными факторами защиты. Большое значение имеют антитела класса IgA. Пассивный естественный иммунитет сохраняется у детей до 8-11 мес жизни.
Лабораторная диагностика. Материалом для обнаружения вируса или вирусного антигена служат мазки-отпечатки со слизистой оболочки носовой полости, отделяемое носоглотки, при летальных исходах - кусочки легочной ткани или мозга. Экспресс-диагностика основана на выявлении вирусного антигена с помощью РИФ; разработана тест-система для ИФА. Для выделения вирусов используют куриные эмбрионы. Индикацию вирусов гриппа осуществляют при постановке реакции гемагглютинации. Идентифицируют выделенные вирусы поэтапно: типовую принадлежность определяют с помощью РСК, подтип - РТГА. Серодиагностику проводят с помощью РСК, РТГА, РН в культуре клеток, реакции преципитации в геле, ИФА.
Специфическая профилактика и лечение. Для специфической профилактики используют живые и инактивированные вакцины из вирусов гриппа A (H1N1), A (H3N2) и В, культивируемых в куриных эмбрионах. Существует три типа инактивированных вакцин: вирионные (корпускулярные); расщепленные, в которых структурные компоненты вириона разъединены с помощью детергентов; субъединичные, содержащие только гемагглютинин и нейраминидазу. Вакцину из трех вирусов гриппа вводят интраназально в одной прививочной дозе по специальной схеме. Вакцинация показана определенным контингентам, имеющим высокий риск заражения.
Проходит испытания культуральная инактивированная вакцина. Ведутся разработки по созданию гриппозных вакцин нового поколения: синтетических, генно-инженерных. К сожалению, в отдельные годы отмечается довольно низкая эффективность вакцинации вследствие высокой изменчивости вирусов гриппа.
Для лечения, а также экстренной профилактики гриппа применяют химиотерапевтические противовирусные препараты (ремантадин, виразол, арбидол и др.), препараты интерферона и иммуномодуляторы (дибазол, левамизол и др.). При тяжелом течении гриппа, особенно у детей, показано применение донорского противогриппозного иммуноглобулина, а также препаратов, являющихся ингибиторами клеточных протеаз: гордокса, контрикала, аминокапроновой кислоты.
Конкретные цели:
-
Трактовать стадии взаимодействия вируса с клеткой.
-
Ознакомиться с методами культивирования вирусов.
-
Ознакомиться со строением куриного эмбриона.
-
Указать специфические изменения в эмбрионе.
-
Ознайомиться с техникой введения вирусосодержащего материала в аллантоисную полость.
-
Ознайомиться с понятием о клеточной культуры и ЦПД вируса гриппа в ней.
Уметь:
-
Заражать куриные эмбрионы в аллантоисную полость.
-
Вскрывать куриные эмбрионы.
-
Изучить изменения на хорион-аллантоисной оболочке, вызванные вирусом гриппа.
-
Забирать аллантоисную жидкость из куриного эмбриона.
-
Ставить реакцию гемагглютинации и проводить ее учет.
Теоретические вопросы:
-
Классификация вирусов, вызывающих острые респираторные заболевания.
-
Характеристика вирусов гриппа.
-
Строение вириона.
-
Строение генома (взаимодействие вируса с клеткой).
-
Антигенная структура вирусов гриппа.
-
Изменчивость вирусов гриппа.
-
Основные методы культивирования вируса гриппа (заражение куриного эмбриона, культуры клеток).
-
Патогенез гриппа.
-
Микробиологическая диагностика гриппа.
-
Особенности противогриппозного иммунитета. Антитела. Интерферон. Механизм их действия.
-
Вакцины и профилактические препараты.
Практические задания, которые выполняются на занятии:
-
Вскрытие куриного эмбриона.
-
Забор аллантоисной жидкости.
-
Постановка и учет РГА.
-
Разбор и запись схемы лабораторной диагностики гриппа.
-
Микроскопия и зарисовка демонстрационных препаратов в протокол занятия.
-
Оформление протокола.
Литература:
-
Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією.– Київ: Вища школа, 1992.– 431 с.
-
Воробьев А.В., Быков А.С., Пашкола Е.П., Рибакова А.М. Микробиология.– М.: Медицина, 1998.– 336 с.
-
Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.– М.: ГЄОТАР-МЕД, 2001.– 768 с.
-
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под редакцией академика А.А. Воробьева, М.: Медицинское информационное агентство, 2004.– 691 с.
-
Конспект лекции.
Дополнительная литература:
-
Збірник завдань для підготовки до тестового екзамену Крок-1. Загальна лікарська підготовка.– Київ.: Медицина, 2004.- С. 300-333.
-
Методические указания для преподавателей к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии.– Харьков,1986.– 125 с.
-
Сборник тестовых заданий для самоподготовки по медицинской микробиологии и вирусологии.– Харьков, 2005.– 28 с.