Литература

Abelson J. (1977). Recombinant DNA: examples of present-day research, Science, 196, 159-160.

Abelson J. (1980). A revolution in biology, Science, 209, 1319-1321.

Arber W. (1979). Promotion and limitation of genetic exchange, Science, 205, 361-365.

Berg P. (1981). Dissections and reconstructions of genes and chromosomes, Science, 213, 296-303.

BittleJ.L. et al. (1982). Protection against footand-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence, Nature, 298, 30-33.

Britten R., Kohne D. E. (1968). Repeated sequences in DNA, Science, 161, 529-540.

Chang S., Cohen S. N. (1977). In vivo site-specific genetic recombination promoted by the Eco RI restriction endonuclease, Proc. Nat). Acad. Sci. USA, 74, 4811-4815.

Gilbert W. (1 98 1 ). DNA sequencing and gene structure, Science, 214, 1305-1312.

Greever R.F. et al. (1981). Direct identification of sickle cell anemia by blot hybridization, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5081-5085.

Itakura K. et al. (1977). Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin, Science, 198, 1056-1063.

Laird C.D., McCarthy B.J. (1969). Molecular characterization of the Drosophila genome, Genetics, 63, 865-882.

Maniatis T. et al. (1978). The isolation of structural genes from libraries of eucaryotic DNA, Cell, 15, 687-701.

Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J., 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. [Имеется перевод: Маниаmuc Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Молекулярное клонирование, М., Мир.]

Nathans D. (1979). Restriction endonucleases, simian virus 40, and the new genetics, Science, 206, 903-909.

Roberts R. J. (1976). Restriction endonucleases, CRC Crit. Rev. Biochem., 4, 123-164.

Rodriguez R.L., Tait R. С., 1983. Recombinant DNA Techniques: An Introduction, Addison-Wesley, Reading, Mass.

Songer F. (1981). Determination of nucleotide sequences in DNA, Science, 214, 1205-1210.

Smith И.О. (1979). Nucleotide sequence specificity of restriction endonucleases, Science, 205, 455-462.

Valenzuela P. et al. (1982). Synthesis and assembly of hepatitis B virus surface antigen particles in yeast, Nature, 298, 347-350.

Wetmur J., Davidson N. (1968). Kinetics of renaturation of DNA, J. Mol. Biol., 31, 349-370.

Библиотека генома

Вектор для клонирования ДНК

Зонд

Карта сайтов рестрикции

Кинетика ренатурации ДНК

Линкер

Метод Саузерна

Определение нуклеотидной последовательности

Палиндромная нуклеотидная последовательность

Прогулка по хромосоме

Рекомбинантная ДНК

Уравнение C₀t

Фермент модификации ДНК

Фермент рестрикции ДНК

Электрофорез в геле

9.1. Препарат линейной вирусной ДНК обрабатывают указанными ниже ферментами и их комбинацией. Получившийся набор рестриктов подвергают электрофорезу. На основе представленных в таблице результатов постройте карту рестрикции вирусной ДНК.

9.2. Препарат кольцевой плазмидной ДНК подвергают действию указанных ферментов, а затем анализируют фрагменты при электрофорезе в геле. Используя представленную информацию, постройте карту рестрикции этой плазмидной ДНК.

9.3. Препарат линейной вирусной ДНК обрабатывают рестриктазой Sma I до полного расщепления. Электрофорез в геле выявляет присутствие фрагментов сле-

дующих размеров (т. п. н.): 10, 7, 6, 3 и 2. Параллельно интактную вирусную ДНК расщепляют той же эндонуклеазой неполностью. Полученные при неполном расщеплении пять фрагментов обозначены в порядке убывания размеров буквами от А до Е. Затем каждый из этих фрагментовобработан рестриктазой Sma I до полного расщепления и подвергнут электрофорезу. Полученные результаты представленыв таблице. Постройте карту рестрикции Sma I вирусной ДНК.

9.4. Препарат кольцевой плазмидной ДНК длиной 18 т. п. н подвергают полнойрестрикции эндонуклеазой Kut I. Электрофорез в геле выявляет наличие фрагментов следующих размеров: 5,0; 4,0; 3,5; 3,0; 1,5 и 1,0. Неполная рестрикция интактнойплазмидной ДНК той же эндонуклеазой с последующим разделением фрагментов посредством электрофореза в геле показывает существование пяти фрагментов, обозначенных в порядке убывания размеров буквами от А до Е. Результаты последующей полной рестрикции этих фрагментов представлены в таблице. Постройте рестрикционную карту кольцевой плазмидной ДНК.

9.5. Фрагмент, полученный при расщеплении рестриктазой Bgl II ДНК Cannabis sativa клонируется в сайте Bam HI плазмиды pBR322. При попытке выделить этот важный участок из плазмидной ДНК оказывается, что ни Bam HI, ни Bgl II не вырезают ДНК С. sativa из плазмидной. Почему? Какой фермент рестрикции следует использовать, чтобы выделить растительную ДНК из рекомбинантной плазмиды?

9.6. При конструировании векторов серии харон оказывается, что все фаговые частицы несут встроенные участки ДНК. Почему не обнаруживаются фаговые частицы, которые несут лишь левое и правое плечо молекулы ДНК вектора.

9.7. Линейный фрагмент ДНК Eco RI длиной 2,5 т. п. н. с единственным сайтомрестрикции Hha I клонируется в сайте Eco RI плазмиды длиной 5 т. п. н. Карты рестрикции этих двух молекул ДНК изображены на рис. 9.20. Участки линейной ДНК могут быть клонированы в двух ориентациях.

Рис. 9.20. Карты сайтов рестрикции молекул ДНК из условия задачи 9.7.

1) Каковы два способа ориентации?

2) Совместная обработка рестриктазами Hin dIII и Hha I дает фрагменты длиной 1 и 6,5 т. п.н. Какова ориентация клонируемого фрагмента?

9.8. Фрагмент ДНК длиной в 10 пар нуклеотидов был помечен с 3'-конца и последовательность нуклеотидов определялась способом, схематически изображенным на рис. 9.8. Результаты предста-

влены в таблице. Какова нуклеотидная последовательность фрагмента?

9.9. Расщепление ДНК фага λ рестриктазой Нin dIII дает семь фрагментов (рис. 9.7). Продумайте постановку простого эксперимента с использованием полинуклеотидкиназы, позволяющего определить, какие из двух фрагментов содержат концевые точки ДНК λ.

9.10. Дано два препарата интактной ДНК фага λ: один дикого типа и второй λ dgal. Фаг λ dgal комплементирует мутанты по гену К, но не комплементирует мутанты по гену J (см. рис. 7.7). Сравните картину распределения Hin III-рестриктов, которую вы ожидаете получить при расщеплении ДНК λ dgal, с соответствую-

щей картиной для ДНК фага дикого типа, представленной на рис. 9.7. Полный ответ требует решения задачи 9.9.

9.11. Используемые при клонировании фаги λ могут включать до 20 т. п. н. интегрированной чужеродной ДНК. С другой стороны, космиды (гибрид фага λ с плазмидой) могут включать и переносить до 54 т. п. н. чужеродной ДНК. Что бы вы выбрали при создании библиотеки ДНК человека и почему? Геном человека содержит около 3·10⁹ нуклеотидных пар.

9.12. На рис. 9.21 изображен график кинетики ренатурации фрагментированной ДНК троглодита. Что вы можете сказать о его геноме, основываясь на следующих данных: 1) геном Е. coli содержит 3,2 · 10⁶ пар нуклеотидов и имеет мол. массу 2,5·10⁹ Да; 2) график кинетики ренатурации ДНК Е. coli, производившейся в тех же условиях, что и представленный на рис. 9.21, характеризуется значением c₀t_1/2 = 5; 3) содержание ДНК в сперме троглодита составляет 37,5·10⁹ Да.

9.13. Серьезные разногласия вызывает вопрос о том, являются ли хромосомы эукариот унинемными или полинемными, т. е. содержат ли они одну или несколько идентичных ДНК. Как может способствовать решению этого вопроса исследование кинетики ренатурации?

Рис. 9.21. Кинетика ренатурации фрагментированной ДНК троглодита из условия задачи 9.12.