Определение последовательности нуклеотидов в днк ( секвенирование )

Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК было создано несколько методов. Во всех этих методах ферменты рестрикции используются для фиксации специфических «точек отсчета». Последовательность нуклеотидов определяют в одноцепочечных фрагментах, состоящих из 100-200 нуклеотидов. Более длинные последовательности составляются из коротких фрагментов с частично перекрывающимися концами. При секвенировании комплементарной цепи проверяется правильность описания последовательности нуклеотидов в первой цепи.

Все методы определения последовательности нуклеотидов основаны на создании исходного набора одноцепочечных фрагментов ДНК, начинающихся в определенной точке и оканчивающихся определенным нуклеотидом, тогда как размеры фрагментов могут быть различны. Каждый такой исходный набор фрагментов затем фракционируют по размерам посредством электрофореза в геле. Фрагменты должны быть помечены радиоактивным изотопом, для того чтобы их размер можно было определять путем радиоавтографии геля. Принципы секвенирования изображены схематически на рис. 9.8.

Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу радиоактивного мечения, и кроме того по способу выделения исходного набора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят радиоактивным изотопом ³²Р в 5'-конце с использованием [γ — ³²Р] АТР и фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплементарные цепи разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь; звездочка обозначает радиоактивную метку ³²Р на 5'-конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5'-конце содержат радиоактивную метку, а на другом конце-определенный нуклеотид (см. рис. 9.8). (При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми З'-концами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле «бок о бок». Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5'-конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду.

274Организация и передача генетического материала

Рис. 9.8. Основные принципы определения нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот. Меченные радиоактивным изотопом (*) фрагменты одноцепочечной ДНК подвергают химической обработке четырьмя различными методами, в результате чего образуются четыре группы фрагментов, в каждой из этих групп фрагменты случайной длины оканчиваются определенным нуклеотидом. Все четыре набора фракционируют затем по размерам посредством электрофореза. Нуклеотидная последовательность при этом может считываться непосредственно с радиоавтографа электрофоретического геля (последовательность стрелок от полосы к полосе на диаграмме).

9. Методы работы с ДНК275

Рис. 9.9. Радиоавтограф электрофоретического геля, по которому считывают нуклеотидную последовательность методом Максама - Гилберта. Изображена последовательность нуклеотидов, заключенная между двумя генами α-глобина ДНК человека. Фрагмент ДНК был помечен на 3'-конце и обработан рестриктазами, расщепляющими по G, С, G и А и С и Т (для определения нуклеотидной последовательности нет необходимости в том, чтобы расщепление цепи происходило по единственному основанию). Слева представлена последовательность, которую можно считать с геля.