Література

1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – 736с.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508с.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744с.

Обговорено і затверджено на засіданні кафедри, протокол №1 від 28.08.2008р.

Зав. кафедрою проф. Ерстенюк А.М.

Заняття №7

Тема: регуляція ферментативних процесів.

Актуальність теми: Механізми регуляції метаболічних процесів за рахунок впливу на активність ферментів мають важливе значення в медичній практиці.

Навчальні цілі:

Знати: механізми регуляції активності ферментів.

Вміти: визначати вплив малонової кислоти на активність сукцинатдегідрогенази і трактувати одержані дані.

Самостійна позааудиторна робота

В зошитах для протоколів:

1. намалюйте схему взаємодії алостеричних ферментів з субстратами, активаторами та інгібіторами.

2. підготуйте вихідні дані для оформлення протоколу лабораторної роботи „Визначення активності сукцинатдегідрогенази мітохондрій”.

Контрольні питання

1. Поняття про алостеричний центр ферментів.

2. Алостерична регуляція активності ферментів.

3. Ковалентна модифікація ферментів.

4. Регуляція шляхом обмеженого протеолізу. Проферменти (зимогени).

5. Роль циклічних нуклеотидів в регуляції ферментативних процесів.

6. Дія регуляторних білків-ефекторів (кальмодуліну, протеїназ).

7. Регуляція кількості ферментів шляхом регуляції його синтезу і розпаду. Конституційні і адаптивні ферменти.

Самостійна аудиторна робота

1. Дайте відповіді на наступні запитання за схемою:

Фермент Механізм регуляції

АТФ-синтаза

Глікогенсинтаза

Глікогенфосфорилаза

Пепсиноген

Хімотрипсиноген

Протеїнкіназа

Фосфодіестераза

2. Виконати лабораторну роботу „Визначення активності сукцинатдегідрогенази мітохондрій”

і захистити протокол.

Сукцинатдегідрогеназа м’язів - це залізофлавопротеїн, що каталізує окислення (дегідрування) янтарної кислоти у фумарову. Коферментом сукцинатдегідрогенази служить флавінаденіндинуклеотид (ФАД). Активність ферменту залежить від наявності в ньому вільних сульфгідрильних груп та атомів заліза.

Як джерело ферменту використовується відмита м’язева тканина. Дію цього ферменту можна виявити при додаванні до янтарної кислоти метиленової синьки або 2,6-дихлорфеноліндофенолу (синього кольору), які виступають в якості акцептора водню і, відновлюючись, перетворюються у безбарвну форму.

Принцип методу. Метод грунтується на виявленні знебарвлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу в реакції з янтарною кислотою в присутності м’язів як джерела ферменту сукцинатдегідрогенази. Конкурентне гальмування активності цього ферменту викликає малонова кислота НООС-СН₂-СООН, яка є структурним аналогом янтарної кислоти.

Хід роботи. Свіжу м’язеву тканину (1 г) подрібнюють ножицями і розтирають в ступці з невеликою кількістю води (2-3 мл) протягом 1 хв. Одержаний гомогенат переносять на подвійний шар марлі, розміщеної на лійці, промивають водою, ставлять на фільтрувальний папір і висушують.

В три пробірки наливають по 3 мл фосфатного буферу (рН 7,4) і поміщають в них по 0,1г м’язевого гомогенату. Потім в дослідну пробірку додають 5 крапель 3% р-ну янтарної кислоти і для нейтралізації 5 крапель 0,1н р-ну їдкого натрію, а в контрольну - 10 крапель дистильованої води. В третю пробірку додають 5 крапель 3% р-ну малонової кислоти, 5 крапель 3% р-ну янтарної кислоти і 5 крапель 0,1н р-ну їдкого натрію. У всі пробірки доливають по 1 мл 0,001 н р-ну дихлорфеноліндофенолу і вміст їх добре перемішують. Проби ставлять в термостат при 37^оС на 40 хв. Відмічають знебарвлення вмісту в першій пробірці і порівнюють її з контролем і пробіркою, де знаходився конкурентний інгібітор сукцинатдегідрогенази - малонова кислота. Час знебарвлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу в присутності янтарної кислоти характеризує активність сукцинатдегідрогенази.