Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

барбитала, объем которого равен объему отброшенного супернатанта, клетки

ресуспендируют и отделяют, как описано выше, и повторяют операцию промывки. Оставшиеся 200 мкл доводят до объема, составляющего ¾ Vs, получая таким

образом начальный объем (Vi). 900 мкл буферного раствора альбумина и барбитала смешивают с 100 мкл Vi, получая таким образом остаточный объем (Vr), и

определяют исходную оптическую плотность при длине волны 541 нм (А). Vr

разбавляют буферным раствором альбумина и барбитала с коэффициентом разведения, равным А, получая таким образом конечный корректированный объем Vf = Vr × A сенсибилизированных человеческих эритроцитов и значение А

десятикратного разведения, составляющее после коррекции 1,0 ± 0,1.

Связывание антителами таннированных человеческих эритроцитов,

покрытых антигенами. Готовят последовательность следующих растворов (каждый

– в двух повторностях), используя для каждого из них отдельную кювету для полумикроопределений (например, одноразового применения) или пробирку:

(1)Испытуемые растворы. При необходимости доводят значение рН испытуемого иммуноглобулина до 7, например, добавлением 1 М раствора гидроксида натрия. Объемы испытуемого препарата, содержащие 30 и 40 мг иммуноглобулина, доводят до 900 мкл буферным раствором альбумина и барбитала.

(2)Растворы сравнения. Готовят так же, как и испытуемые растворы с использованием человеческого иммуноглобулина BRP.

(3)Контроль комплемента. 900 мкл буферного раствора альбумина и барбитала.

Ксодержимому каждой кюветы или пробирки добавляют по 100 мкл сенсибилизированных человеческих эритроцитов и хорошо перемешивают.

Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, добавляют 1000 мкл буферного раствора альбумина и барбитала, отделяют клетки центрифугированием кюветы или пробирки (1000 g в течение 10 минут) и отбрасывают 1900 мкл супернатанта. Добавляют вместо отброшенного супернатанта 1900 мкл буферного

раствора альбумина и барбитала и повторяют всю операцию промывки, оставляя

объем 200 мкл. Испытуемые образцы могут храниться в укупоренных кюветах (пробирках) при 40С в течение 24 часов.

Инициируемый комплементом гемолиз. Для измерения степени гемолиза к испытуемому образцу добавляют 600 мкл предварительно нагретого до 370С буферного раствора альбумина и барбитала, осторожно ресуспендируют клетки

путем не менее чем пятикратных повторных пипетирований и помещают кювету в

термостатированный держатель кювет спектрофотометра. Через 2 минуты добавляют 200 мкл разведенного комплемента морских свинок (125-200 СН50/мл),

тщательно перемешивают путем двукратного пипетирования и тотчас же после второго пипетирования начинают регистрацию оптической плотности при длине

волны 541 нм в зависимости от времени с использованием в качестве раствора сравнения буферного раствора альбумина и барбитала. Измерение прекращают при

очевидном прохождении графиком зависимости оптической плотности от времени точки перегиба.

Оценка. Определяют угол наклона (S) кривой гемолиза в районе точки перегиба

путем сегментации участка с наибольшим уклоном на подходящие временные отрезки t (например, t = 1 мин) и вычисляют значения S между соседними точками

пересечений, выраженные в А/мин. Наибольшее значение S принимают за (Sexp).

Кроме того, определяют оптическую плотность в начале измерения (As) путем

экстраполяции кривой, практически линейной и параллельной оси времени в

течение первых нескольких минут. Значение (Sexp) корректируют по формуле:

S'= Sexp

As

Вычисляют среднее арифметическое значений S’ для каждого препарата.

Вычисляют индекс функции Fc (IFc) по формуле:

Вычисляют индекс функции Fc для испытуемого препарата: значение должно быть не ниже указанного на листке-вкладыше, сопровождающем препарат сравнения.

2.7.10. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА VII

Количественное определение фактора свертывания крови VII производят по

его биологической активности в виде комплекса фактора VIIa с тканевым фактором при активации фактора Х в присутствии ионов кальция и фосфолипидов. Активность

препарата фактора VII оценивают путем сравнения количества, необходимого для

достижения определенной скорости образования фактора Ха в испытуемой смеси, содержащей вещества, принимающие участие в активации фактора Х, и количества Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для достижения такой же скорости образования фактора Ха.

За Международную Единицу принимают активность фактора VII в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенной

из замороженного состояния плазмы. Эквивалентность Международного Стандарта

в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией

здравоохранения.

Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии. Первая стадия состоит в зависящей от фактора VII активации фактора Х смесью реагентов, включающей тканевый фактор,

фосфолипиды и ионы кальция. На второй стадии происходит ферментативное

расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В соответствующих условиях

испытания существует линейная зависимость между скоростью образования фактора Ха и концентрацией фактора. Содержание метода количественного определения описывается схемой 2.7.10.-1:

Схема 2.7.10.-1. – Схема количественного определения фактора коагуляции крови

человека VII.

В обеих стадиях используются реагенты, доступные из ряда коммерческих источников. Хотя в состав реагентов могут вноситься некоторые изменения, их

основные свойства должны соответствовать нижеприведенным спецификациям.

РЕАГЕНТЫ

Реагент факторов коагуляции состоит из очищенных белков человеческого или говяжьего происхождения, включающих фактор Х и тромбопластиновый тканевый фактор / фосфолипид в качестве активатора фактора VII. Эти белки

подвергнуты частичной очистке и не должны содержать примесей, мешающих активации фактора VII или фактора Х. Фактор Х содержится в количествах, приводящих к конечной концентрации на первой стадии определения, находящейся в пределах от 10 до 350 нмоль/л, предпочтительно от 14 до 70 нмоль/л. В качестве

тканевого фактора/фосфолипида может использоваться тромбопластин,

полученный из природных источников, например, из мозга крупного рогатого скота или кроликов, или синтетический препарат. Тромбопластин, подходящий для использования в определении протромбинового периода, разбавляют буфером в соотношении от 1:5 до 1:50 так, чтобы окончательная концентрация ионов кальция

составляла от 15 до 25 ммоль/л. Образование конечного фактора Ха проводят в

растворе, содержащем человеческий или бычий альбумин в концентрации, не допускающей потери адсорбции, и соответствующим образом буферизированного до рН 7,3–8,0. В окончательной инкубационной смеси фактор VII должен быть единственным компонентом, лимитирующим скорость.

Вторая стадия включает количественное определение образовавшегося

фактора Ха с использованием специфичного в отношении фактора Ха хромогенного субстрата. Обычно он представляет собой короткий пептид, состоящий из 3–5 аминокислотных остатков, присоединенный к хромофорной группе. При отщеплении

этой группы от пептидного субстрата ее хромофорные свойства смещаются к длине

волны, при которой становится возможным произвести спектрофотометрическое определение. Субстрат обычно растворяют в воде R и используют в конечных

концентрациях 0,2–2 ммоль/л. Субстрат также может содержать подходящие ингибиторы для прекращения дальнейшего образования фактора Ха (добавка

эдетата).

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Восстанавливают полное содержимое одной ампулы препарата сравнения и испытуемого препарата путем добавления подходящего количества воды R; используют в течение 1 часа. Восстановленные препараты дополнительно разбавляют прерастворителем, получая растворы с содержанием от 0,5 до 2,0 МЕ/мл фактора VII.

Готовят дальнейшие разведения испытуемого и стандартного препаратов с

использованием изотонического нехелатирующего буфера, содержащего 1%

человеческого или бычьего альбумина и предпочтительно буферизированного при

рН от 7,3 до 8,0. Готовят не менее трех отдельных, независимых разведений каждого препарата. Предпочтительно каждое из разведений готовить в двух

повторностях. Разведения готовят таким образом, чтобы окончательная концентрация фактора VII была ниже 0,005 МЕ/мл.

Готовят контрольный раствор, включающий все компоненты, кроме фактора

VII.

Все разведения готовят в пластиковых пробирках и используют в течение 1 часа.

1-я стадия. Разведения образца сравнения фактора VII и испытуемого

препарата смешивают с подходящим объемом предварительно нагретого реагента

факторов свертывания крови или со смесью реагентов, его составляющих, и

инкубируют смесь в пластиковых пробирках или ячейках планшета при температуре

370С. Концентрации компонентов в процессе образования фактора Ха должны соответствовать спецификациям, приведенным выше, при описании реагентов.

Активацию фактора Х проводят в течение подходящего промежутка времени,

предпочтительно прерывая реакцию до достижения концентрацией фактора Ха ее

максимального уровня с целью получения удовлетворительной линейной

зависимости отклика от дозы. Время активации выбирается также таким образом, чтобы достичь линейного во времени образования фактора Ха. Подходящие

периоды активации обычно находятся в пределах от 2 до 5 минут, но допускаются и

другие значения при условии получения таким образом приемлемой линейности зависимости отклика от дозы.

2-я стадия. Активацию прерывают добавлением предварительно нагретого реагента, содержащего хромогенный субстрат. Проводят количественную оценку скорости расщепления субстрата, которая должна находиться в линейной зависимости от концентрации образовавшегося фактора Ха, измеряя изменение

оптической плотности при соответствующей длине волны с помощью

спектрофотометра. Оптическую плотность отслеживают постоянно, получая таким образом возможность вычислить начальную скорость расщепления субстрата, либо

прерывают реакцию гидролиза по окончании подходящего промежутка времени

путем понижения рН добавлением подходящего реагента, например, уксусной кислоты (500 г/л С2Н4О2) или раствора цитрата (1 моль/л) с рН 3. Время гидролиза

регулируют с целью достижения линейного характера образования хромофора во

времени. Подходящими обычно являются периоды гидролиза от 3 до 15 минут, но

допускаются и другие значения при условии получения таким образом лучшей

линейности зависимости отклика от дозы.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого

препарата с использованием обычных статистических методов (например, 5.3.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и

количественных определений).

2.7.11. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IX

Активность определяют путем сравнения количества испытуемого препарата,

необходимого для уменьшения времени свертывания испытуемой смеси, содержащей вещества, отличные от фактора IX, принимающие участие в процессе

коагуляции, и количества препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для получения такого же эффекта.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния концентрата фактора свертывания крови человека IX.

Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Восстанавливают по отдельности испытуемый препарат и препарат сравнения

в соответствии с указаниями на этикетке и используют немедленно. В случае необходимости, определяют количество присутствующего гепарина (2.7.12) и

нейтрализуют гепарин добавлением протамина сульфата R (10 мкг протамина сульфата нейтрализуют 1 МЕ гепарина). Испытуемый препарат и препарат

сравнения разбавляют количеством имидазольного буферного раствора рН 7,3 R,

достаточным для получения растворов с содержанием от 0,5 до 2,0 МЕ/мл. Готовят двукратные разведения в диапазоне от 1:10 до 1:80 с использованием смеси 1 объема раствора натрия цитрата R концентрацией 38 г/л и 5 объемов

имидазольного буферного раствора рН 7,3 R. Разведения производят с высокой

точностью и используют немедленно.

В определении могут использоваться, например, инкубационные пробирки,

температура которых поддерживается с помощью водяной бани на уровне 370С. В

каждую пробирку помещают по 0,1 мл субстрата плазмы R2 и по 0,1 мл одного из разведений испытуемого препарата или препарата сравнения. К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,1 мл подходящего разведения цефалина R или

заменителя тромбоцитов R и 0,1 мл суспензии 0,5 г легкого каолина R в 100 мл раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Пробирки выдерживают около 10 минут, время от времени переворачивая. К содержимому каждой пробирки

добавляют по 0,1 мл раствора кальция хлорида R концентрацией 7,4 г/л. С

использованием секундомера измеряют время коагуляции, т.е. интервал времени между добавлением хлорида кальция и первыми признаками образования фибрина,

которые можно определять либо визуально, либо с применением соответствующей

аппаратуры. Вычисляют активность с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).

Для подтверждения отсутствия в субстрате плазмы R2 существенного количества фактора IX выполняют контрольный опыт с использованием вместо

испытуемого препарата соответствующего количества смеси 1 объема раствора

натрия цитрата R концентрацией 38 г/л и 5 объемов имидазольного буферного

раствора рН 7,3 R. Результаты испытания считают достоверными, если время коагуляции в контрольном опыте составляет от 100 до 200 секунд.

2.7.12. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕПАРИНА В КОНЦЕНТРАТАХ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

Гепарин определяют в виде комплекса с антитромбином III (АТ) по его

способности к ингибированию фактора свертывания крови Ха (анти-Ха активность).

В реакционной смеси поддерживают избыток АТ для обеспечения постоянной

концентрации комплекса гепарина с АТ. Фактор Ха нейтрализуется комплексом

гепарина с АТ, а его избыток гидролизует специфический хромофорный пептидный субстрат с высвобождением хромофора. Количество хромофора обратно

пропорционально активности гепарина.

Хромогенный субстрат фактора Ха. Специфический хромогенный

субстрат для фактора Ха, например N-бензоил-L-изолейцил-L-глутамил-глицил-L- аргинина 4-нитроанилида гидрохлорид. Субстрат восстанавливают в соответствии с указаниями изготовителя.

Буфер для разведений. Раствор трис-(гидроксиметил)-аминометана R

концентрацией 6,05 г/л. При необходимости доводят значение рН до 8,4

добавлением хлористоводородной кислоты R.

Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для разведений, получая раствор с ожидаемым содержанием 0,1 МЕ/мл.

Стандартный раствор. Препарат сравнения разбавляют буфером для разведений, получая раствор с ожидаемым содержанием 0,1 МЕ/мл.

Нижеописанные условия определения относятся к титрационным микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут

изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.

Перед началом испытания все растворы быстро нагревают на водяной бане

до 370С.

В ряд ячеек распределяют по 20 мкл нормальной человеческой плазмы и по 20 мкл раствора антитромбина III R1. Добавляют в ячейки ряда 20, 60, 100 и 140

мкл испытуемого или стандартного раствора и доводят объемы в каждой из ячеек до

200 мкл с использованием буфера для разведений (содержание гепарина в конечной смеси 0,02–0,08 МЕ/мл).

Метод конечной точки. По 40 мл содержимого каждой из ячеек переносят во второй ряд ячеек, добавляют по 20 мкл раствора бычьего фактора Ха R и инкубируют при 370С в течение 30 секунд. Добавляют по 40 мкл раствора хромогенного субстрата фактора Ха концентрацией 1 ммоль/л и инкубируют при

370С в течение 3 минут. Реакцию прерывают путем снижения показателя рН

добавлением походящего реагента, например, раствора ледяной уксусной кислоты R концентрацией 20 объемных процентов, и определяют оптическую плотность при

длине волны 405 нм (2.2.25). Обычно подходящей является продолжительность

реакции от 3 до 15 минут, но допускаются отклонения от этого интервала при

условии получения лучшей линейности зависимости отклика от дозы.

Кинетический метод. По 40 мл содержимого каждой из ячеек переносят во

второй ряд ячеек, добавляют по 20 мкл раствора бычьего фактора Ха R и инкубируют при 370С в течение 30 секунд. Добавляют по 40 мкл раствора

хромогенного субстрата фактора Ха концентрацией 2 ммоль/л, инкубируют при 370С

и регистрируют скорость расщепления субстрата путем постоянного измерения

оптической плотности при длине волны 405 нм (2.2.25), определяя таким образом начальную скорость расщепления субстрата. Это значение должно находиться в

линейной зависимости от остаточной концентрации фактора Ха.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность гепарина в испытуемом препарате с использованием обычных статистических методов, подходящих для анализа результатов измерения углов наклона (например, 5.3.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и

количественных определений).

2.7.13. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АНТИ-D- ИММУНОГЛОБУЛИНА

МЕТОД А

Активность человеческого анти-D-иммуноглобулина определяют путем сравнения количества препарата, необходимого для агглютинации D-положительных эритроцитов с количеством препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, необходимым для получения того же эффекта.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандартного Образца. Эквивалентность

Международного Стандартного Образца в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческого анти-D-иммуноглобулина BRP

калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом

и предназначен для использования в количественных определениях человеческого анти-D-иммуноглобулина.

Используют пул D-положительных эритроцитов, собранных не более чем за 7 дней до испытания, хранившихся соответствующим образом и полученных не менее

чем от четырех групп доноров с группой 0 R1R1. К подходящему объему клеток,

предварительно трижды промытых раствором натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, добавляют равный объем раствора бромелайна R, выдерживают при 370С в

течение 10 минут, центрифугируют, отделяют супернатант и промывают трижды

раствором натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. 20 объемов эритроцитов суспендируют в смеси 15 объемов инертной сыворотки, 20 объемов раствора бычьего альбумина R концентрацией 300 г/л и 45 объемов раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Полученную суспензию охлаждают ледяной водой при постоянном перемешивании.

Сиспользованием калиброванного автоматического прибора для разведения

ираствора для разведений, содержащего 5 г/л бычьего альбумина R и 9 г/л натрия

хлорида R, готовят подходящие разведения испытуемого препарата и препарата сравнения.

Определение обычно проводят по изложенной ниже методике, используя

соответствующий прибор для непрерывного автоматического гемолитического анализа. Температуру в трубопроводе, кроме инкубационных ячеек, поддерживают на уровне 15,00С. Вводят с помощью насоса в трубопровод аппарата суспензию

эритроцитов со скоростью 0,1 мл/мин и раствор метилцеллюлозы 450 R концентрацией 3 г/л со скоростью 0,05 мл/мин. В течение 2 минут со скоростью 0,1

мл/мин вводят разведения испытуемого препарата и препарата сравнения. Перед введением очередного разведения вводят в течение 4 минут со скоростью 0,1

мл/мин раствор для разведений.

Вводят воздух со скоростью 0,6 мл/мин. Инкубируют при 370С в течение 18

минут, после чего рассеивают столбики эритроцитов путем введения со скоростью

1,6 мл/мин раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, содержащего подходящий увлажняющий агент (например, полисорбат 20 R в окончательной концентрации 0,2 г/л) для предотвращения разрушения аппликаций. После оседания агглютинатов дважды декантируют: вначале со скоростью 0,4 мл/мин, затем – со

скоростью 0,6 мл/мин. Эритроциты, не подвергшиеся агглютинации, лизируют

раствором, содержащим 5 г/л октоксинола 10 R, 0,2 г/л калия феррицианида R, 1

г/л натрия гидрокарбоната R и 0,05 г/л калия цианида R и подаваемым со скоростью 2,5 мл/мин. Система включает петлю для получения десятиминутной

задержки, необходимой для конверсии гемоглобина. Оптическую плотность (2.2.25) гемолизата регистрируют непрерывно при длине волны, выбранной в интервале от

540 до 550 нм. Определяют диапазон концентраций антител, на протяжении

которого существует линейная зависимость между концентрацией и полученным изменением оптической плотности ( А). Исходя из полученных результатов, строят градуировочную кривую, участок линейности которой используют для определения активности испытуемого препарата.

Активность испытуемого препарата вычисляют с использованием обычных

статистических методов (5.3).

МЕТОД В

Активность человеческого анти-D-иммуноглобулина определяют методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, производимого на титрационных микропланшетах, покрытых эритроцитами. Метод основан на

конкурентном связывании между поликлональным препаратом анти-D- иммуноглобулина и биотинированными моноклональными анти-D-антителами, направленными против специфического эпитопа D-антигена. Активность

испытуемого препарата сравнивают с препаратом сравнения, калиброванным в

Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандартного Образца. Эквивалентность

Международного Стандартного Образца в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческого анти-D-иммуноглобулина BRP

калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом

и предназначен для использования в количественных определениях человеческого анти-D-иммуноглобулина.

МАТЕРИАЛЫ

Реагенты, для которых нет особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты.

СФБ (раствор хлорида натрия в фосфатном буфере). 8,0 г натрия хлорида R, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,2 г калия хлорида R, 0,2 г калия дигидрофосфата R и 0,2 г натрия азида R растворяют в воде R и разбавляют до

1000 мл тем же растворителем.

СТБ (раствор хлорида натрия в трис-буфере). 8,0 г натрия хлорида R и 0,6 г

трис-(гидроксиметил)-аминометана R растворяют в воде R. Доводят значение рН до 7,2 (2.2.3) с помощью 1 М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000

мл тем же растворителем.

Раствор папаина. Раствор готовят перемешиванием при 370С в течение 30

минут 1 г папаина R в 10 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора рН 5,4 R,

центрифугированием при 10000 g в течение 5 минут и фильтрованием через

мембрану с размером пор 0,22 мкм. Для активации смешивают 1 мл фильтрата, 1 мл раствора L-цистеина R концентрацией 48,44 г/л и 1 мл раствора натрия эдетата R концентрацией 3,72 г/л и разбавляют до 10 мл 0,067 М фосфатным буферным раствором рН 5,4 R. Аликвоты замораживают при температуре –200С и ниже.

Эритроциты. Используют пул D-положительных эритроцитов, полученных не

менее чем из трех групп доноров с группой 0 R1R1. Клетки промывают четырежды СФБ. Центрифугируют при 1800 g в течение 5 минут, смешивают подходящий объем

предварительно нагретых упакованных клеток с подходящим объемом предварительно нагретого раствора папаина (объемное соотношение 2:1 было

найдено подходящим) и инкубируют при 370С в течение 10 минут. Клетки промывают четырежды СФБ. Хранят при 40С с подходящим стабилизатором не более недели.

Биотинированный Brad-5. Используют в соответствии с инструкциями.

Щелочной авидин-стрептавидиновый реагент, связанный с фосфатазой.

Предпочтительно использовать модифицированный реагент, сочетающий высокую специфическую активность с низким уровнем неспецифического связывания.

Используют в соответствии с инструкциями.

Раствор субстрата. Используют в соответствии с инструкциями пара-

нитрофенилфосфат.

Буфер для фиксации клеток. 18,02 г глюкозы R, 4,09 г натрия хлорида R,

1,24 г борной кислоты R, 10,29 г натрия цитрата R и 0,74 г натрия эдетата R

растворяют в воде R. Доводят показатель рН (2.2.3) до 7,2–7,3 добавлением 1 М

раствора натрия гидроксида или 1 М хлористоводородной кислоты и разбавляют

водой R до 1000 мл. Хранят при температуре 40С. Используют непосредственно из

места хранения.

Раствор глутарового альдегида. Непосредственно перед применением 90 мкл раствора глутарового альдегида R концентрацией 250 г/л добавляют к 24 мл

холодного СФБ.

Титрационные микропланшеты. Планшеты, предназначенные для покрытия эритроцитами, представляют собой плоскодонные планшеты из полистирола со свойствами поверхности, оптимизированными для иммуноферментного анализа и с большой емкостью в отношении связывания с белками. Планшеты, используемые для приготовления разведений иммуноглобулина, представляют собой планшеты из полистирола или поливинилхлорида с U- или V-образными формами ячеек.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Готовят 0,1% (по объему) суспензию обработанных папаином эритроцитов в холодном буфере для фиксации клеток. В каждую ячейку плоскодонного

титрационного микропланшета помешают по 50 мкл суспензии.

Планшет центрифугируют при 350 g в течение 3 минут, предпочтительно, при 40С. Не удаляя супернатант, к содержимому каждой из ячеек осторожно добавляют по 100 мкл раствора глутарового альдегида и выдерживают в течение 10 минут.

Содержимое ячеек сливают путем быстрого переворачивания планшета и трижды промывают каждую ячейку 250–300 мкл СФБ. Эта операция может производиться

либо вручную, либо с использованием автоматического устройства для промывания планшетов. Планшет либо используют в нижеописанном испытании, либо после

сливания СФБ, добавления в каждую ячейку 100 мкл буфера для фиксации клеток и запечатывания пластиковой пленкой хранят при 40С не более 1 месяца.

Испытуемые растворы. В случае лиофильно высушенных препаратов их

восстанавливают в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят в четырех независимых повторностях 5 серийных двукратных разведений, начиная с концентрации 30 МЕ/мл с использованием СФБ, содержащего 10 г/л бычьего альбумина R. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью

получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости

отклика от дозы.

Растворы сравнения. Восстанавливают препарат сравнения в соответствии с

указаниями на этикетке. Готовят в четырех независимых повторностях 5 серийных двукратных разведений, начиная с концентрации 30 МЕ/мл с использованием СФБ,

содержащего 10 г/л бычьего альбумина R.

В ячейки каждого из рядов титрационного микропланшета с U- или V- образными формами ячеек вносят по 35 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения. К содержимому каждой из ячеек добавляют по 35

мкл биотинированного Brad-5 с содержанием 250 нг/мл.

Освобождают ячейки планшета, покрытого эритроцитами, путем

переворачивания и высушивания бумажным полотенцем. Добавляют по 250 мкл СФБ, содержащего 20 г/л бычьего альбумина R и оставляют при комнатной

температуре на 30 минут.

Освобождают ячейки планшета, покрытого эритроцитами, путем

переворачивания и высушивания бумажным полотенцем и помещают в каждую из ячеек по 50 мкл каждого из разведений испытуемого раствора и раствора сравнения, содержащих биотинированный Brad-5. 50 мкл СФБ, содержащего 10 г/л бычьего

альбумина R, используют в качестве отрицательного контроля. Планшет

запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в

течение 1 часа.

Удаляют жидкость из ячеек планшета, покрытого эритроцитами, и трижды

промывают каждую ячейку 250–300 мкл СТБ.

Щелочной авидин-стрептавидиновый реагент, связанный с фосфатазой, разбавляют СТБ, содержащим 10 г/л бычьего альбумина R и добавляют в количестве по 50 мкл в каждую из ячеек. Инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре.

Удаляют жидкость из ячеек планшета, покрытого эритроцитами, и трижды промывают каждую ячейку 250–300 мкл СТБ.

В каждую из ячеек добавляют по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в

темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Для остановки реакции в каждую из ячеек добавляют по 50 мкл 3 М раствора натрия гидроксида.

Измеряют значения оптической плотности при длине волны 405 нм и

вычитают значение, полученное для отрицательного контроля. Значения оптической

плотности в области линейности кривой титрования используют для оценки активности испытуемого препарата с использованием обычных статистических

методов (5.3).

МЕТОД С

Активность человеческого анти-D-иммуноглобулина определяют методом поточной цитометрии в формате титрационного микропланшета. Метод основан на

специфическом связывании между анти-D-иммуноглобулином и В-положительными эритроцитами. Активность испытуемого препарата сравнивают с препаратом сравнения, калиброванным в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандартного Образца. Эквивалентность

Международного Стандартного Образца в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.