Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

анализа. Для проведения статистического анализа результатов должно быть ис-

пытано не менее трех независимых рядов разведений в количестве повторностей для каждого из разведений, достаточном для получения всего 24 результатов ис-

пытания для каждого разведения.

Например, в лаборатории в разные дни могут быть проведены испытания

трех рядов разведений в восьми повторностях для каждого из них, четырех рядов разведений в шести повторностях для каждого из них или шести рядов разведе- ний в четырех повторностях для каждого из них. Для того, чтобы число разведе- ний не было слишком большим, следует провести предварительное испытание

(например, с использованием логарифмических разведений образца пула плаз- мы) с получением предварительного положительного граничного значения (т.е.

наибольшего значения, дающего положительный результат). После этого диапа-

зон разведений может быть выбран в области полученного предварительного

значения (с использованием, например, логарифмического фактора разведения 0,5 или менее и отрицательного пула плазмы для матрицы разведения). Концен-

трация РНК HCV, которая может быть детектирована в 95% испытаний, может

быть вычислена с использованием соответствующих методов статистической оценки.

Эти результаты также могут служить для демонстрации изменчивости ре- зультатов, получаемых данным аналитическим методом, в ходе испытания и в

разные дни.

4. УСТОЙЧИВОСТЬ

Устойчивость аналитического метода – мера его способности выдерживать

воздействие малых, но определенных изменений параметров метода, являющая- ся показателем его надежности при обычном использовании.

Оценка надежности должна проводиться в фазе разработки. Она должна

показать надежность аналитической процедуры с учетом определенных вариаций параметров метода. Для случая МАНК, небольшие изменения параметров метода могут иметь решающее значение. Однако, в ходе разработки метода его устойчи-

вость может быть продемонстрирована небольшим изменением концентраций

реагентов (например, MgCl2, праймеров или dNTP). Для демонстрации устойчиво- сти не менее 20 РНК HCV-отрицательных пулов плазмы, отобранных случайным

образом и инфицированных РНК HCV с получением конечной концентрации, в три

раза превышающей заранее определенное 95% граничное значение, должны быть испытаны и признаны положительными.

Проблемы с устойчивостью могут возникнуть также в связи с методами, в

которых экстракции вирусной РНК предшествует стадия ультрацентрифугирова- ния. Поэтому для испытания устойчивости таких методов не менее 20 пулов

плазмы, содержащих различные уровни РНК HCV, но не содержащих специфиче- ских антител к HCV, должны быть испытаны и признаны положительными.

Предотвращение перекрестной контаминации должно быть продемонстри- ровано путем точной детекции панели из не менее 20 образцов, попеременно за-

полненной образцами отрицательных пулов плазмы и отрицательных пулов плаз- мы, инфицированных высокими концентрациями HCV (не менее 100-кратного 95%

граничного значения или не менее 104 МЕ/мл). 5. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА

Для таких биологических испытаний, как МАНК, имеется вероятность воз-

никновения специфических проблем, которые могут повлиять как на валидацию,

так и на интерпретацию результатов. Методики испытаний должны быть четко

описаны в форме стандартных операционных процедур (СОП). В них должно ука- зываться:

-способ отбора проб (тип контейнеров и т. д.),

-приготовление мини-пулов (по потребности),

-условия хранения до анализа,

-точное описание условий испытания, включая меры предосторожности против перекрестной контаминации и деструкции вирусной РНК, используемых реагентов и стандартных препаратов,

-точное описание используемой аппаратуры,

-детальные формулы для вычисления результатов, включая статистическую об-

работку.

Вкачестве удовлетворительной проверки соответствия системы и надеж-

ности аналитической процедуры, когда бы она ни использовалась, может быть ре- комендован подходящий контроль процесса (например, подходящее разведение

стандартного образца вируса гепатита С BRР или образец плазмы, инфициро-

ванной HCV, калиброванным в сравнении с Международным Стандартном HCV

ВОЗ 96/790).

Техническая квалификация: каждой критической части используемого обо-

рудования должна соответствовать программа квалификации по установке и экс-

плуатации. После замены критически важного оборудования (например, устройств для термоциркуляции) должна быть документально подтверждена производи-

тельность путем проведения параллельного испытания в отношении 8 повторных

образцов пула плазмы, инфицированного РНК HCV с получением конечной кон- центрации, соответствующей предварительно определенному трехкратному 95% граничному значению. Все результаты должны быть положительными.

Квалификация оператора: в отношении каждого оператора, принимающего участие в испытании, должна действовать соответствующая квалификационная программа. Для подтверждения соответствующего уровня подготовки каждый

оператор должен провести испытание не менее 8 повторяющихся образцов пула

плазмы, инфицированного РНК HCV с получением конечной концентрации, соот- ветствующей предварительно определенному трехкратному 95% граничному зна-

чению. Это испытание (8 повторяющихся образцов) должно быть повторено два-

жды, в два различных дня. Таким образом, должно быть проведено 24 испытания на протяжении трех дней. Все результаты должны быть положительными.

2.6.22. АКТИВИРОВАННЫЕ ФАКТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

При необходимости определяют количество присутствующего гепарина (2.7.12) и нейтрализуют его добавлением протамина сульфата R (10 мкг прота- мина сульфата нейтрализуют 1 МЕ гепарина). Готовят разбавления испытуемого препарата в соотношениях 1:10 и 1:100 с использованием трис-(гидроксиметил)-

аминометанового буферного раствора рН 7,5 R. Ряд пробирок из полистирола помещают в водяную баню с температурой 370С и добавляют к каждой из проби-

рок по 0,1 мл плазмы с пониженным содержанием тромбоцитов R и по 0,1 мл подходящего разведения цефалина R или заменителя тромбоцитов R. Выдер-

живают в течение 60 секунд. К каждой пробирке добавляют либо 0,1 мл одного из

разведений, либо 0,1 мл буферного раствора (контрольная пробирка). К содержи- мому каждой пробирки немедленно добавляют 0,1 мл предварительно нагретого

до 370С раствора кальция хлорида R концентрацией 3,7 г/л и в течение 30 минут

от момента первоначального разведения измеряют время между добавлением

раствора хлорида кальция и формированием сгустка. Результаты считают досто- верными, если время коагуляции в контрольной пробирке составило от 200 до 350 секунд.

2.7 Биологические методы количественного определения

2.7.1. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Иммунохимические методы основаны на селективном, обратимом

нековалентном связывании антигенов антителами. Эти методы используются для обнаружения и количественного определения как антигенов, так и антител. Факт

образования комплекса антигена с антителом и количество этого комплекса могут быть определены различными путями. Положения данного общего метода относятся

к иммунохимическим методам с использованием меченых или немеченых реагентов.

Результаты, получаемые иммунохимическими методами, зависят от

реакционных условий, а также природы и качества используемых реагентов. Важно стандартизировать компоненты, используемые в ходе иммуноанализа и, по

возможности, использовать для количественных определений международные стандартные препараты.

Реагенты, необходимые для многих иммунохимических методов, содержатся в

составе коммерчески доступных наборов, т.е. наборов, включающих реагенты (антигены или антитела) и материалы, предназначенные для оценки in vitro указанной субстанции, а также инструкции по их надлежащему применению. Наборы используются в соответствии с инструкциями производителя; важно убедиться в том, что наборы являются подходящими для анализа испытуемой субстанции с

особым учетом их селективности и чувствительности.

МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА

В методах с использованием меченых веществ могут применяться

подходящие метки, например, ферменты, флуорофоры, люминофоры и

радиоизотопы. Если меткой является радиоизотоп, метод называют «радиоиммунологическим анализом». Рекомендации по измерению радиоактивности, приведенные в статье «Радиофармацевтические препараты (0125)», подходят также и для иммунологических анализов с использованием радиоизотопов. Работа с радиоактивными материалами должна выполняться в

соответствии с национальным законодательством и международными документами

по защите от радиационной опасности.

МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕМЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА

Методы иммунопреципитации

Методы иммунопреципитации включают процессы флокуляции и осаждения.

При смешивании растворов антигена с соответствующим антителом в подходящих условиях реактанты образуют флокулирующие или преципитационные агрегаты.

Отношение реактантов, при котором достигается минимальное время флокуляции или наиболее заметное осаждение, называют оптимальным отношением. Такое отношение обычно составляют эквивалентные количества антигенов и антител.

Иммунопреципитация может оцениваться визуально или по светорассеянию

(нефелометрическое и турбидиметрическое определение). Увеличение

чувствительности может быть достигнуто использованием в качестве реактантов частиц (например, из латекса), покрытых антигенами или антителами.

В методах флокуляции обычно используют ступенчатые разбавления одного

из реактантов, в то время, как в иммунодиффузионных (ИД) методах разбавление достигается путем диффузии в гелеобразную среду: достигаются концентрационные

градиенты одного из реактантов или обоих. Таким образом, в геле образуются зоны, в которых отношение реактантов способствует преципитации. В то время как

флокуляционные методы выполняются в пробирках, в иммунодиффузионных методах используются различные носители: пробирки, пластины, стекла, ячейки или камеры.

Если система иммунопреципитации состоит из одного антигена в комбинации

с соответствующим антителом, система определяется как простая; если в ней участвуют родственные, но серологически неидентичные реактанты, система

является сложной, а если в ней участвуют несколько серологически не связанных друг с другом реактантов, ее называют комплексной.

В методах простой диффузии концентрационный градиент устанавливается только для одного из реактантов, диффундирующего из внешнего источника в

гелевую среду, содержащую соответствующий реактант в относительно низкой концентрации.

Простая радиальная иммунодиффузия (ПРИД) представляет собой простой

количественный иммуодиффузионный метод. При достижении равновесия между

внешним и внутренним реактантами круговая область преципитации, начинающаяся

от места локализации внешнего реактанта, прямо пропорциональна количеству нанесенного антигена и обратно пропорциональна концентрации антитела в геле.

В двойных диффузионных методах концентрационные градиенты

устанавливаются для обоих реактантов. И антиген, и антитело диффундируют из различных участков в гель, который первоначально был иммунологически нейтральным.

Сравнительные методы двойной диффузии используются для количественного сравнения различных антигенов против подходящих антител или наоборот. Сравнение основано на наличии или отсутствии взаимодействия между

образцами преципитации. Могут быть выделены реакции идентичности,

неидентичности и частичной идентичности антигенов или антител.

Иммуноэлектрофоретические методы

Иммуноэлектрофорез (ИЭ) – качественный метод, сочетающий две

процедуры: гель-электрофорез с последующей иммунодиффузией.

Перекрестный иммуноэлектрофорез представляет собой модификацию

метода ИЭ и является подходящим как для качественного, так и для

количественного анализа. Первая часть процедуры представляет собой обычный гель-электрофорез. По ее окончании протяженную полосу геля, содержащую

разделенные фракции, подлежащие определению, вырезают и переносят на другую пластину. Электрофорез во втором направлении проводят перпендикулярно

предыдущему электрофоретическому процессу в геле, содержащем относительно небольшую концентрацию антитела, соответствующего используемому антигену.

Зависимость площади соответствующих пиков преципитации от количества соответствующего антигена является линейной для данной концентрации антитела и

толщины геля.

Электроиммунный анализ, часто называемый ракетным

иммуноэлектрофорезом представляет собой быстрый метод количественного

определения антигенов с зарядом, отличным от заряда антител, и наоборот.

Выполняют электрофорез антигена, подлежащего определению, в геле,

содержащем относительно низкую концентрацию соответствующих антител. Испытуемый материал и разведения стандартного антигена, используемые для

калибровки, вносят в разные лунки в геле. В процессе электрофореза появляются мигрирующие пикообразные зоны преципитации, начинающиеся от лунок. Фронт

преципитации становится неподвижным, когда количество антигена перестает быть избыточным. Зависимость расстояния, пройденного фронтом преципитации, от

количества нанесенного антигена является линейной для данной концентрации антител.

Обратный иммуноэлектрофорез представляет собой быстрый метод количественного определения, позволяющий устанавливать концентрационные

градиенты внешних антител и антигенов в электрическом поле в зависимости от разницы зарядов. Разведения стандарта для калибровки и разведения испытуемого

материала вносят в ряд лунок в геле, а в противоположный ряд лунок вносят фиксированное количество соответствующего реактанта. Титр испытуемого

материала может быть определен как максимальное разведение, для которого наблюдается линия преципитации.

Существует ряд модификаций методов перекрестного иммуноэлектрофореза

иэлектроиммунного анализа.

Вдругих методах сочетается разделение антигенов по размеру молекул и

серологическим свойствам.

Визуализация и характеризация линий иммунопреципитации.

Эти операции могут быть выполнены с использованием селективных или

неселективных красителей, по флуоресценции, введением ферментных или изотопных меток или другими подходящими методами. Для характеризации в

преципитатах веществ небелковой природы обычно используют методы селективного окрашивания.

В полупрозрачных гелях, например, на основе агара или агарозы, линии

осаждения четко различимы визуально при условии наличия достаточной

концентрации каждого из реактантов.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА

Критерии валидации

Количественный иммунохимический метод является достоверным при выполнении следующих условий:

1.Антитела и антигены не имеют существенных отличий в стандартном и

испытуемом образце. В случае меченых реактантов, различия меченого и

немеченого компонента соответствующего реактанта должны быть

незначительными.

2.На результат не должна оказывать влияния матрица, т.е. любой компонент

испытуемого образца или используемые вспомогательные вещества, которые могут отличаться в разных образцах. В образцах могут содержаться высокие концентрации посторонних белков, солей, консервантов или веществ, обладающих протеолитической активностью.

3.Предел количественного определения должен быть ниже критерия, установленного в частной статье.

4.Точность определения должна быть достаточной для выполнения требований,

предъявляемых в частных статьях.

5.Порядок, в котором проводится определение, не приводит к увеличению

системных ошибок.

Методы валидации

Для проверки выполнения этих критериев разрабатывается процесс валидации, включающий следующие элементы:

1.Испытание выполняют не менее чем в трех повторностях.

2.Испытание проводят не менее чем для трех различных разведений препарата

сравнения и трех разведений испытуемых препаратов, предполагаемая активность которых равна активности стандартного образца.

3.Используют рандомизированную схему количественного определения.

4.Если испытуемый препарат находится в сыворотке или в смеси с иными

компонентами, стандарт должен быть приготовлен аналогичным образом.

5.Испытание должно включать измерение неспецифического связывания меченого

реактанта.

6.В случае заместительного иммунного анализа:

a) определяют максимальное связывание (нулевое замещение),

б) разведения должны охватывать весь диапазон откликов от значений, близких к

неспецифическому связыванию, до максимального связывания, предпочтительно,

как для стандартного, так и для испытуемого препарата.

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ВЫЧИСЛЕНИЯ

Кривые откликов, полученные для испытуемого и стандартного препаратов,

могут быть проанализированы с использованием методов, описанных в разделе 5.3.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений.

Существенная степень непараллельности указывает на то, что между антителом и антигеном в испытуемом и стандартном образцах имеются различия, и результаты испытания являются недостоверными.

В заместительных иммунологических количественных определениях не

должно быть существенных различий между значениями неспецифического

связывания и максимального замещения при высокой концентрации испытуемого

образца и стандарта. Различия могут указывать на наличие эффектов, связанных с матрицей: ингибированием связывания либо разложением метки.

2.7.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Активность антибиотика определяют путем сравнения степени угнетения

роста чувствительных микроорганизмов под действием испытуемого антибиотика и стандартного образца в известных концентрациях.

Стандартные образцы, используемые для количественного определения, представляют собой субстанции, активность которых точно установлена по отношению к международному стандарту.

# Для количественного определения используют ФСО.

Определение должно выполняться способом, позволяющим производить проверку достоверности математической модели, на которой основан расчет

активности. Если выбрана модель параллельных линий, линии логарифмической

зависимости активности от дозы для испытуемого препарата и стандартного образца

должны быть параллельны; они должны быть линейны в области доз, использовавшихся при вычислении. Эти условия должны быть проверены тестами соответствия для определенной вероятности, обычно Р = 0,05.

# Вычисления целесообразно проводить по схеме латинских квадратов (если

при проведении анализа методом диффузии в агар были использованы прямоугольные кюветы) или по схеме рандомизированных блоков (если при

проведении анализа методом диффузии в агар были использованы чашки Петри или анализ проводился турбидиметрическим методом).

Могут быть использованы и другие математические модели, например, модель отношения уклонов прямых, при условии доказательства их достоверности.

Если в частной статье не указано иное, доверительные интервалы ошибки количественного определения активности (Р = 0,95) должны составлять от 95% до 105% от оцениваемой активности.

Определение выполняют методом А или методом В, если иное не указано в

частной статье.

А. МЕТОД ДИФФУЗИИ

Питательную среду определенного состава расплавляют, засевают

суспензией микроорганизмов, чувствительных к испытуемому антибиотику, при подходящей температуре, например, 48-50°С для вегетативных форм и 65-70°С при использовании суспензии спор. Количество суспензии микроорганизмов выбирают таким образом, чтобы образовывались четко определенные зоны ингибирования требуемого диаметра при концентрациях антибиотика, используемых в определении. Инокулированная среда разливается по чашкам Петри или по

прямоугольным кюветам на строго горизонтальной поверхности в количестве,

достаточном для формирования однородного слоя толщиной от 2 до 5 мм. Среда может также состоять из двух слоев, из которых только верхний подвергался

инокуляции. Чашки хранят таким образом, чтобы не происходило заметного роста

или гибели микроорганизмов до использования, а поверхность среды была сухой к

моменту использования.

Используя растворитель и буферный раствор, указанный в Таблице 2.7.2.-1,

готовят растворы стандартного образца и испытуемого антибиотика, имеющие известные концентрации и предположительно равные активности. Растворы наносят

на поверхность среды, например, в стерильных цилиндрах из фарфора, нержавеющей стали или другого подходящего материала, или в лунках, сделанных в

агаре. В каждый цилиндр или лунку должны быть помещены равные объемы раствора. Кроме того, можно использовать стерильные диски абсорбирующей

бумаги подходящего качества; диски пропитывают растворами стандартного

образца и растворами испытуемого антибиотика и помещают на поверхность агара.

Для оценки достоверности количественного определения используют не менее трех доз стандартного образца и трех доз испытуемого антибиотика, имеющих равные предполагаемые активности. Предпочтительно использовать ряды

доз, меняющихся в геометрической прогрессии.

# Например, в соотношении 1:2:4.

В рутинных анализах, когда линейность системы продемонстрирована в адекватном количестве экспериментов с определением по трем значениям, по

согласованию с компетентными органами может считаться достаточным определение по двум значениям. Однако во всех спорных случаях должно

применяться вышеописанное определение по трем значениям.

Растворы в каждой чашке Петри или прямоугольной кювете располагают статистически предпочтительным образом, кроме чашек Петри малого размера, на которых невозможно разместить больше шести растворов; растворы испытуемого

антибиотика (U) и стандартного образца (S) чередуют таким образом, чтобы исключить взаимное влияние более концентрированных растворов.

# Последовательность внесения стандартного и испытуемого образцов в цилиндры или лунки каждой чашки рекомендуется следующей: первыми вносятся

растворы стандартного и испытуемого образца с малой концентрацией (S1, U1), затем со средней концентрацией (S2, U2), последними вносят растворы с большими

концентрациями (S3, U3).

# Все растворы стандартного испытуемого образцов вносят в цилиндры или

лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы с большими

концентрациями не соприкасались между собой. Предлагаемый вариант

закапывания S1 U3 S2 U1 S3 U2.

Чашки инкубируют при подходящей температуре около 18 часов. Чашки могут выдерживаться до инкубации при комнатной температуре или, если необходимо, при

4 С0 в течение определенного промежутка времени, обычно от 1 до 4 часов для

протекания диффузии, что уменьшает эффекты вариаций временных интервалов между нанесением растворов и улучшает качество кривой регрессии.

Измеряют диаметры (с точностью не ниже 0,1 мм) или площади кольцевых зон ингибирования (с соответствующей точностью) и вычисляют активность с использованием подходящих статистических методов.

В каждом определении используют достаточное для получения требуемой

точности количество повторов. Может быть проведено несколько определений,

результаты которых статистически обработаны для получения требуемой точности и для подтверждения того, что активность испытуемого антибиотика не ниже

минимальных требований.

Таблица 2.7.2.-1.

Количественное определение методом диффузии.