Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB
.pdfV2 - наименьший объем испытуемого раствора гепарина, задерживающий
свертывание плазмы, в миллилитрах; А - предполагаемая активность.
Определение проводят не менее трех раз и берут средний результат.
Примечания:
1.Приготовление 8 % раствора натрия цитрата. 8 г натрия цитрата помещают
вмерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл воды, доводят объем
раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
2.Приготовление 10 % раствора кальция хлорида. 10 г кальция хлорида
безводного помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Срок годности
раствора 1 месяц при температуре от 0 до +4°С.
3.Приготовление плазмы. Кровь, вытекающую из сосудов убойного животного, собирают в банки из полиэтилена вместимостью 1 л, содержащие от 25 до 30 мл 8 %
раствора натрия цитрата.
Кровь осторожно смешивают с 8 % раствором натрия цитрата, поворачивая баню, и как можно быстрее центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 минут,
после чего плазму отсасывают.
Плазму хранят в замороженном состоянии при температуре от -10 до -20°С во флаконах вместимостью от 50 до 150 мл, избегая ее оттаивания.
Перед употреблением плазму размораживают на водяной бане или термостате при температуре 37 ± 0,5°С. Затем плазму фильтруют через марлю,
проверяют время ее свертывания и оценивают оптимальное количество кальция
хлорида, необходимое для определения активности: в 5 пробирок с 1 мл плазмы в каждой прибавляют возрастающие количества 10 % раствора кальция хлорида (0,02
-0,04 - 0,06 - 0,08 -0,10 мл) и осторожно смешивают. Для опыта используют плазму, время свертывания которой не превышает 10 минут и то оптимальное количество
кальция хлорида, которое вызывает полное свертывание плазмы в указанное время.
Найденное оптимальное количество кальция хлорида должно содержаться в 0,2 мл рабочего раствора (этот раствор готовят разведением 10 % раствора кальция хлорида). Срок годности плазмы 1 год при температуре от - 10 до -20°С.
4.Приготовление раствора стандартного образца гепарина. Навеску гепарина
-стандартного образца растворяют в растворе натрия хлорида изотоническом 0,9 %
с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось 50 ЕД.
Срок годности раствора 6 месяцев при температуре от 0° С до +4 °С.
Предварительно из гепарина - стандартного образца готовят растворы,
содержащие в 1 мл 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 ЕД. По 0,5 и 0,72 мл полученных растворов помещают в пробирки, доводят объем раствора в пробирке до 0,8 мл раствором
натрия хлорида изотоническим 0,9 %. Затем прибавляют по 1 мл плазмы и 0,2 мл
кальция хлорида оптимальной концентрации и перемешивают.
Через 1 час определяют состояние плазмы в каждой пробирке и устанавливают активность раствора гепарина - стандартного образца, при которой в пробирке, содержащей 0,5 мл раствора гепарина, происходит полное свертывание
плазмы, а в другой пробирке, содержащей 0,72 мл этого раствора гепарина, плазма
не свернулась. Выбранная активность обеспечивает наблюдение за влиянием испытуемого гепарина - стандартного образца на свертывание плазмы по истечении
часа. Обычно эта активность находится в пределах 1 - 1,5 ЕД для плазмы КРС и 1 -
3,5 ЕД для бараньей плазмы.
5. Приготовление раствора испытуемого препарата. Навеску препарата
растворяют в растворе натрия хлорида изотоническом 0,9%, исходя из его предполагаемой активности с таким расчетом, чтобы 1 мл полученного раствора
содержал столько же единиц гепарина, сколько содержит 1 мл раствора гепарина - стандартного образца. Раствор используют свежеприготовленным.
6. При необходимости разрешается сдвигать ряд пробирок, указанный в таблице, в сторону уменьшения концентрации раствора гепарина.
2.7.6. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ ДИФТЕРИИ (АДСОРБИРОВАННОЙ)
Количественное определение вакцины дифтерии (адсорбированной) производят путем сравнения дозы вакцины, необходимой для защиты морских
свинок от эффектов либо эритрогенной дозы вводимого интрадермально токсина дифтерии, либо летальной дозы вводимого подкожно токсина дифтерии, с дозой
препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, требующейся для получения такой же защиты.
За Международную Единицу принимают активность в установленном
количестве Международного Стандарта, состоящего из дифтерийного анатоксина, адсорбированного на гидроксиде алюминия. Эквивалентность Международного
Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией
здравоохранения.
В нижеописанном методе количественного определения используется модель параллельных линий с использованием трех разведений испытуемого и стандартного препаратов. Если аналитик обладает достаточно большим опытом работы с применением этого метода для данной вакцины, разрешается использовать упрощенную модель, включающую одно разведение для испытуемого
и стандартного препаратов. Такая модель позволяет определять, обладает ли
вакцина активностью, существенно превышающей необходимый минимум, но не
дает информации о линейности и параллельности и кривой зависимости отклика от
дозы. Упрощенная модель приводит к существенному уменьшению требуемого
количества экспериментальных животных; она должна приниматься во внимание
каждым аналитиком в соответствии с положениями Европейской конвенции по
защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других
научных целях.
МЕТОД ИНТРАДЕРМАЛЬНОЙ ПРОВОКАЦИИ
Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых белых морских свинок из одной партии размером, подходящим для предписанного количества точек введения. Разница в массе между самым тяжелым и самым легким животным не должна превышать 100 г. Морских свинок делят не менее чем на шесть равных групп; количество животных в группах должно быть достаточным для получения результатов, выдерживающих требования к достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом стандартизирован, используют пять морских свинок в качестве невакцинированного
контроля. Используют морских свинок одного пола; в иных случаях самцы и самки
должны быть равномерно распределены по группам.
Выбор провокационного токсина. Препарат токсина дифтерии должен
содержать от 67 до 133 lr/100 в 1 Lf и от 25000 до 50000 минимальных реактивных доз для кожи морских свинок в 1 Lf. Если было показано, что препарат токсина
обладает стабильностью, проверка его активности перед каждым определением не является обязательной.
Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно
перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим
растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего около 0,0512 Lf в 0,2 мл. Из него путем дальнейших четырехкратных разведений
получают ряд из пяти растворов, содержащих около 0,0128, 0,0032, 0,0008, 0,0002 и 0,00005 Lf в 0,2 мл.
Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R
концентрацией 9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата
сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд не более чем с 2,5-кратным различием между последовательными разведениями, и в
котором промежуточные разведения при подкожном введении морской свинке в дозе
1,0 мл приводят в результате провокации к получению интрадермальной суммы,
составляющей около 3. Каждое разведение назначают одной из групп морских
свинок, каждой из которых вводят подкожно по 1,0 мл этого разведения. Через 28 дней каждой морской свинке обривают оба бока и вводят интрадермально по 0,2 мл
каждого из шести разведений токсина в шесть различных точек на коже каждой из
вакцинированных морских свинок таким образом, чтобы минимизировать помехи между соседними локализациями.
Определение активности провокационного токсина. При необходимости,
невакцинированным контрольным животным вводят разведения, содержащие 80, 40, 20, 10 и 5 миллионных долей Lf провокационного токсина.
Получение и интерпретация результатов. Все точки провокации
контролируют через 48 часов после инъекции провокационного токсина и
записывают частоту возникновения специфической дифтерийной эритемы. Записывают также количество точек, в которых такие реакции не возникли и
обозначают это количество как сумму интрадермальной провокации. Суммы
интрадермальной провокации для всех животных, получивших одно и то же разведение вакцины, сводят в таблицу и используют эти данные после подходящего преобразования, например, (сумма)2 или arcsin((сумма/6)2) для оценки
относительной активности для каждого из испытуемых препаратов методом параллельных линий.
Требования к достоверности определения. Результаты испытания
являются достоверными, если:
-как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, средняя сумма, полученная для нижнего уровня дозировки, менее 3, а средняя сумма, полученная
для верхнего уровня дозировки, более 3,
-в случае проведения соответствующего испытания, разведение токсина с
содержанием 40 миллионных долей Lf приводит к положительной эритеме не менее чем у 80% морских свинок, а разведение с содержанием 20 миллионных долей Lf приводит к положительной эритеме менее чем у 80% морских свинок (если эти
критерии не выполняются, следует выбрать другой токсин),
-границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50
до 200% от оцененного значения активности,
-при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и
параллельности.
Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более
одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех достоверных экспериментов.
МЕТОД ЛЕТАЛЬНОЙ ПРОВОКАЦИИ
Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют
здоровых морских свинок из одной партии с массой тела от 250 до 350 г. Морских свинок делят не менее, чем на шесть равных групп; количество животных в группах
должно быть достаточным для получения результатов, выдерживающих требования к достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что
используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом стандартизирован, дополнительно используют четыре группы по пять морских
свинок в качестве невакцинированного контроля. Используют морских свинок одного пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по группам.
Выбор провокационного токсина. Препарат токсина дифтерии должен
содержать не менее 100 LD50 в миллилитре. Если было показано, что препарат
токсина обладает стабильностью, проверка его активности перед каждым определением не является обязательной.
Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно
перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего около 100 LD50 в миллилитре. При необходимости порции раствора провокационного токсина разбавляют тем же растворителем в соотношениях 1:32, 1:100 и 1:320.
Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R
концентрацией 9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата
сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд с не
более чем 2,5-кратным различием между последовательными разведениями и в
котором промежуточные разведения при подкожном введении морской свинке в дозе
1,0 мл защищают около 50% животных от летальных эффектов, вызываемых
подкожным введением количества дифтерийного токсина, предписанного для этого испытания. Растворы каждого разведения назначают одной из групп морских свинок, каждой из которых вводят подкожно по 1,0 мл этого разведения. Через 28 дней
каждому животному вводят подкожно по 1,0 мл раствора провокационного токсина
(100 LD50).
Определение активности провокационного токсина. При необходимости,
раствор провокационного токсина и три приготовленных из него разведения
назначают по одному каждой из 4 групп по 5 морских свинок и вводят подкожно по 1,0 мл каждого разведения каждой из морских свинок группы, которой это
разведение было назначено.
Получение и интерпретация результатов. Через 4 дня после инъекции провокационного токсина подсчитывают число выживших морских свинок.
Активность испытуемой вакцины вычисляют относительно активности препарата сравнения с использованием обычных статистических методов на основе пропорции
выживших животных в каждой из групп вакцинированных морских свинок.
Требования к достоверности определения. Результаты испытания
являются достоверными, если:
-как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная
доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными морским свинкам,
-в случае проведения соответствующего испытания, количество погибших животных в 4 группах по 5 морских свинок, которым был введен раствор провокационного токсина и его разведения, указывает на то, что провокационная доза приблизительно соответствует 100 LD50,
-границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50 до 200% от оцененного значения активности,
-при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.
Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех
достоверных экспериментов.
2.7.7. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ КОКЛЮША
Активность вакцины коклюша определяют путем сравнения дозы вакцины,
необходимой для защиты мышей от эффектов летальной дозы Bordetella pertussis, вводимой интрацеребрально, с количеством препарата сравнения, калиброванного в
Международных Единицах, требующимся для получения такой же защиты.
За Международную Единицу принимают активность в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенной вакцины коклюша. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют
здоровых мышей подходящей линии из одной партии, возрастом менее 5 недель.
Разница в массе между самым тяжелым и самым легким животным не должна
превышать 5 г. Мышей делят на шесть групп не менее чем по 16 особей и 4 группы по 10 особей. Используют мышей одного пола; в иных случаях самцы и самки
должны быть равномерно распределены по группам.
Выбор провокационного штамма и приготовление суспензии для провокации. Выбирают подходящий штамм B. pertussis, способный привести к гибели мышей в течение 14 дней после интрацеребральной инъекции. Если в
течение 48 часов после инъекции погибает более 20% мышей, штамм является неподходящим. Выполняют один пересев штамма и суспендируют собранные B. pertussis в растворе, содержащем 10 г/л гидролизата казеина R и 6 г/л натрия хлорида R, и имеющем показатель рН от 7,0 до 7,2, либо в другом подходящем
растворе. Определяют степень мутности суспензии. Готовят ряд разведений с
использованием того же раствора и назначают их по одному каждой из групп по десять мышей. Каждой мыши вводят интрацеребрально дозу (0,02 или 0,03 мл) разведения, назначенного группе, к которой она принадлежит. Через 14 дней подсчитывают в каждой группе количество выживших мышей. Из этих результатов вычисляют ожидаемую степень мутности суспензии, содержащей 100 LD50 в каждой провокационной дозе. Для оценки активности испытуемой вакцины производят
свежий пересев того же штамма B. pertussis и готовят из собранных организмов
суспензию со степенью мутности, соответствующей приблизительно 100 LD50 в каждой провокационной дозе. Готовят 3 разведения провокационной суспензии.
Определение активности. Готовят 3 серийных разведения испытуемой
вакцины и 3 аналогичных разведения препарата сравнения так, чтобы для каждого
из промежуточных разведений ожидаемая степень защиты мышей от летальных эффектов провокационной дозы B. pertussis составляла 50%. Предлагаемые дозы составляют 1/8, 1/40 и 1/200 доли человеческой дозы испытуемой вакцины и 0,5 МЕ, 0,1 МЕ и 0,02 МЕ препарата сравнения. Каждая из доз содержится в объеме, не
превышающем 0,5 мл. 6 разведений назначают по одному каждой из групп, состоящих не менее, чем из 16 мышей, и вводят каждой из мышей внутрибрюшинно
одну дозу разведения, назначенного группе, к которой относится данное животное. Через 14–17 дней каждому животному из этих групп вводят интрацеребрально одну
дозу суспензии для провокации. Суспензию для провокации и три ее разведения назначают по одному каждой из групп по 10 мышей и вводят каждой из мышей
интрацеребрально одну дозу каждой суспензии, назначенной группе, к которой относится данное животное. Мышей, погибших в течение 48 часов после провокации, не учитывают при оценке результатов. В каждой из групп подсчитывают количество мышей, выживающих после 14 дней. Активность испытуемой вакцины
вычисляют относительно активности препарата сравнения на основе количества
животных, выживших в каждой из групп из не менее 16 особей. Результаты испытания являются достоверными, если:
-как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная
доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными морским свинкам,
-количество погибших животных в 4 группах по 10 мышей, которым была введена провокационная суспензия и ее разведения, указывает на то, что провокационная доза приблизительно соответствует 100 LD50,
-при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и
параллельности.
Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех
достоверных экспериментов.
2.7.8. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ СТОЛБНЯКА (АДСОРБИРОВАННОЙ)
Количественное определение вакцины столбняка (адсорбированной)
производят путем сравнения дозы вакцины, необходимой для защиты морских
свинок или мышей от эффектов паралитической дозы вводимого подкожно токсина
столбняка, с дозой препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, требующейся для получения такой же защиты. В странах, где метод
паралича не является обязательным, может использоваться метод LD50. В этом
случае количества животных и методики идентичны описываемым для метода паралича, но за конечную точку принимают вместо паралича гибель животных.
За Международную Единицу принимают активность в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из столбнячного анатоксина, адсорбированного на гидроксиде алюминия. Эквивалентность Международного
Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией
здравоохранения.
В нижеописанном методе количественного определения используется модель
параллельных линий с использованием трех разведений испытуемого и стандартного препаратов. Если аналитик обладает достаточно большим опытом
работы с применением этого метода для данной вакцины, разрешается использовать упрощенную модель, включающую одно разведение для испытуемого и стандартного препаратов. Такая модель позволяет определять, обладает ли вакцина активностью, существенно превышающей необходимый минимум, но не
дает информации о линейности и параллельности и кривой зависимости отклика от дозы. Упрощенная модель приводит к существенному уменьшению требуемого
количества экспериментальных животных; она должна приниматься во внимание
каждым аналитиком в соответствии с положениями Европейской конвенции по
защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях.
ИСПЫТАНИЕ НА МОРСКИХ СВИНКАХ
Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют
здоровых морских свинок из одной партии с массой тела от 250 до 350 г. Морских
свинок делят не менее чем на шесть равных групп; количество животных в группах
должно быть достаточным для получения результатов, выдерживающих требования
к достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом
стандартизирован, дополнительно используют четыре группы по пять морских
свинок в качестве невакцинированного контроля. Используют морских свинок одного пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по группам.
Выбор провокационного токсина. Препарат токсина столбняка должен содержать не менее пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы в миллилитре. Если было показано, что препарат токсина обладает стабильностью,
проверка его паралитической дозы перед каждым определением не является
обязательной.
Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно
перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим
растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего около пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы в миллилитре. При
необходимости порции раствора провокационного токсина разбавляют тем же
растворителем в соотношениях 1:16, 1:50 и 1:160.
Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R
концентрацией 9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд с не
более чем 2,5-кратным различием между последовательными разведениями и в
котором промежуточные разведения при подкожном введении морской свинке в дозе
1,0 мл защищают около 50% животных от паралитических эффектов, вызываемых подкожным введением количества токсина столбняка, предписанного для этого испытания. Каждое разведение назначают одной из групп морских свинок, каждой из
которых вводят подкожно по 1,0 мл этого разведения. Через 28 дней каждому животному вводят подкожно по 1,0 мл раствора провокационного токсина
(содержащего пятидесятикратную 50%-ную паралитическую дозу).
Определение активности провокационного токсина. При необходимости,
раствор провокационного токсина и три приготовленных из него разведения назначают по одному каждой из 4 групп по 5 морских свинок и вводят подкожно по
1,0 мл каждого разведения каждой из морских свинок группы, которой это разведение было назначено.
Получение и интерпретация результатов. Состояние морских свинок
оценивают дважды в день. Животных с определенными признаками столбнячного паралича изымают и гуманным образом умерщвляют. Через 5 дней после инъекции провокационного токсина подсчитывают число непарализованных морских свинок.
Активность испытуемой вакцины вычисляют относительно активности препарата сравнения с использованием обычных статистических методов на основе пропорции
непарализованных животных в каждой из групп вакцинированных морских свинок.
Требования к достоверности определения. Результаты испытания
являются достоверными, если:
-как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная
доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными морским свинкам,
-в случае проведения соответствующего испытания, количество
парализованных животных в 4 группах по 5 морских свинок, которым был введен
раствор провокационного токсина и его разведения, указывает на то, что провокация
составляла около пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы,
-границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50
до 200% от оцененного значения активности,
-при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.
Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех достоверных экспериментов.
ИСПЫТАНИЕ НА МЫШАХ
Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых мышей из одной партии с массой тела от 14 до 20 г. Мышей делят не менее чем на шесть равных групп; количество животных в группах должно быть
достаточным для получения результатов, выдерживающих требования к
достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом стандартизирован, дополнительно используют четыре группы по шесть мышей в
качестве невакцинированного контроля. Используют мышей одного пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по группам.
Выбор провокационного токсина. Препарат токсина столбняка должен
содержать не менее стократной 50%-ной паралитической дозы в миллилитре. Если
было показано, что препарат токсина обладает стабильностью, проверка его паралитической дозы перед каждым определением не является обязательной.
Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно
перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего около пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы в 0,5 мл. При
необходимости порции раствора провокационного токсина разбавляют тем же растворителем в соотношениях 1:16, 1:50 и 1:160.
Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R
концентрацией 9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд с не
более чем 2,5-кратным различием между последовательными разведениями и в котором промежуточные разведения при подкожном введении мыши в дозе 0,5 мл
защищают около 50% животных от паралитических эффектов, вызываемых подкожным введением количества токсина столбняка, предписанного для этого испытания. Каждое разведение назначают одной из групп мышей, каждой из которых вводят подкожно по 0,5 мл этого разведения. Через 28 дней каждому животному
вводят подкожно по 0,5 мл раствора провокационного токсина (содержащего пятидесятикратную 50%-ную паралитическую дозу).
Определение активности провокационного токсина. При необходимости
раствор провокационного токсина и три приготовленных из него разведения
назначают по одному каждой из 4 групп по 6 мышей и вводят подкожно по 0,5 мл каждого разведения каждой из мышей группы, которой это разведение было
назначено.
Получение и интерпретация результатов. Состояние мышей оценивают
дважды в день. Животных с определенными признаками столбнячного паралича изымают и гуманным образом умерщвляют. Через 4 дня после инъекции провокационного токсина подсчитывают число непарализованных мышей.
Активность испытуемой вакцины вычисляют относительно активности препарата сравнения с использованием обычных статистических методов на основе пропорции
непарализованных животных в каждой из шести групп вакцинированных мышей.
Требования к достоверности определения. Результаты испытания являются достоверными, если:
-как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными мышам,
-в случае проведения соответствующего испытания, количество
парализованных животных в 4 группах по 6 мышей, которым был введен раствор
провокационного токсина и его разведения, указывает на то, что провокация составляла около пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы,
-границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50
до 200% от оцененного значения активности,
-при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.
Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех
достоверных экспериментов.
2.7.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ Fc-ФРАГМЕНТА ИММУНОГЛОБУЛИНА
Стабилизированная человеческая кровь. Человеческую кровь группы 0
собирают в антикоагулянтный раствор ACD. Стабилизированную кровь хранят при 40С не более 3 недель.
Раствор хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2. 1,022 г безводного
натрия гидрофосфата R, 0,336 г безводного натрия дигидрофосфата R и 8,766 г
натрия хлорида R растворяют в 800 мл воды R и разбавляют до 1000 мл тем же
растворителем.
Основной раствор магния и кальция. 1,103 г кальция хлорида R и 5,083 г
магния хлорида R растворяют в воде и разбавляют до 25 мл тем же растворителем.
Основной буферный раствор барбитала. 207,5 г натрия хлорида R и 25,48 г
барбитала натриевой соли R растворяют в 4000 мл воды R и доводят значение рН до 7,3 1 М хлористоводородной кислотой. Добавляют 12,5 мл основного раствора
кальция и магния и разбавляют водой R до 5000 мл. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при 40С в стеклянных контейнерах.
Буферный раствор альбумина и барбитала. 0,150 г бычьего альбумина R
растворяют в 20 мл основного буферного раствора барбитала и разбавляют водой R
до 100 мл.
Раствор дубильной кислоты. 10 мг дубильной кислоты R растворяют в 100
мл раствора хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2. Готовят непосредственно перед использованием.
Комплемент морских свинок. Готовят пул сыворотки из крови не менее 10 морских свинок. Сыворотку отделяют от свернувшейся крови центрифугированием
при температуре около 40С. Сыворотку хранят в небольших количествах при
температуре ниже -700. Непосредственно перед началом гемолиза, инициируемого комплементом, разбавляют буферным раствором альбумина и барбитала до
содержания 125–200 СН50 в миллилитре и хранят в процессе испытания на ледяной
бане.
# СН50 (гемолитическая единица активности комплемента) – концентрация комплемента в контрольной сыворотке, вызывающая в данных реакционных условиях теста агглютинации лизис 50% эритроцитов.
Антиген краснухи. Соответствующий антиген краснухи для титрования по ингибированию гемагглютинации (HIT). Титр должен составлять более 256 НА-
единиц.
Приготовление таннированных человеческих эритроцитов. Эритроциты
отделяют центрифугированием соответствующего объема стабилизированной
человеческой крови. Промывают клетки не менее трех раз раствором хлорида
натрия в фосфатном буфере рН 7,2 и суспендируют в том же растворе, получая
суспензию концентрацией 2 объемных процента. 0,1 мл раствора дубильной кислоты
разбавляют до 7,5 мл раствором хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2
(окончательная концентрация 1,3 мг/л). 1 объем свежеприготовленного разведения смешивают с 1 объемом суспензии эритроцитов и инкубируют при 370С в течение 10
минут. Клетки отделяют центрифугированием (400–800 g в течение 10 минут), супернатант удаляют, а клетки однократно промывают раствором хлорида натрия в
фосфатном буфере рН 7,2. Таннированные клетки снова суспендируют в растворе хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2, получая суспензию концентрацией 1
объемный процент.
Покрытие антигенами таннированных человеческих эритроцитов. К
соответствующему объему (Vs) таннированных клеток добавляют антиген краснухи (0,2 мл на 1,0 мл клеток) и инкубируют при 370С в течение 30 минут. Клетки отделяют центрифугированием (400–800 g в течение 10 минут) и отбрасывают
супернатант, оставляя объем 200 мкл. Добавляют буферный раствор альбумина и