Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

Полисорбат 80 добавляется к горячему раствору остальных ингредиентов

после кипячения, непосредственно перед доведением объема.

Натрия фосфат двузамещенный добавляется в виде стерильного раствора после стерилизации среды.

#

Среда № 1

Среды стерилизуют насыщенным паром под давлением при 121°С 15 минут.

При приготовлении питательных сред вместо раствора гидролизата мяса по

Хоттингеру можно использовать питательные среды на основе рыбного или мясо-

пептонного бульона с таким же содержанием аминного азота

Среды стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121 °С в течение 15 минут.

2.7.3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИКОТРОПИНА

Активность кортикотропина определяют путем сравнения одного или

нескольких из его биологических эффектов с аналогичными эффектами Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в

Международных Единицах при проведении экспериментов в аналогичных условиях.

За Международную Единицу принимают активность установленного

количества Международного Стандарта, состоящего из высушенного из

замороженного состояния очищенного свиного кортикотропина с добавлением лактозы. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец кортикотропин BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом.

В испытании используют крыс обоего пола массой тела от 100 до 200 г.

Разница в массе тела у самого тяжелого и самого легкого животного должна составлять не более 15 г. Крыс содержат в однородных условиях в течение не менее

7 дней до начала испытания. В день, предшествующий испытанию, крыс взвешивают и проводят гипофизэктомию. После операции крысам обеспечивают доступ к раствору глюкозы R концентрацией 50 г/л и раствору натрия хлорида R

концентрацией 1,8 г/л в дополнение к обычной диете и воде и содержат крыс в

помещении с постоянной температурой от 24 до 270С. Испытание выполняют через 18–36 часов после гипофизэктомии.

В день испытания повторно взвешивают животных и делят их случайным образом на 6 групп, каждая из которых состоит из 6–8 особей. Выбирают три дозы

препарата сравнения и три дозы испытуемого препарата таким образом, чтобы наименьшая доза приводила к некоторому уменьшению, а наибольшая доза не

приводила к максимальному уменьшению содержания аскорбиновой кислоты в надпочечниках. Дозы, отрегулированные с учетом массы тела животных, вводят

подкожно в случайном порядке. Подходящими обычно являются дозы порядка 1,0, 0,5 и 0,25 МЕ на 100 г массы тела. Если в частной статье нет иных указаний,

стандартный и испытуемый препараты растворяют в 0,01 М хлористоводородной кислоте и выполняют последовательные разведения водой R, содержащей

желатин R в концентрации 150 г/л. Растворы вводят в течение 4 часов после приготовления.

Через 3 часа после инъекции у анестезированной крысы удаляют обе надпочечные железы, освобождают их от посторонних тканей и по возможности быстро взвешивают для предотвращения потери массы. Крысу умерщвляют и исследуют на предмет полноты гипофизэктомии.

Пару надпочечников измельчают и гомогенизируют в свежеприготовленном

растворе метафосфорной кислоты R концентрацией 25 г/л и разбавляют тем же раствором до 10 мл. Гомогенат выдерживают в течение 30 минут, после чего

центрифугируют. 7 мл прозрачного супернатанта добавляют к свежеприготовленной

смеси, состоящей из 7 мл раствора натрия ацетата R концентрацией 45,3 г/л со значением рН, доведенным до 7 путем добавления уксусной кислоты R, 3 мл воды

R и 2 мл стандартного раствора дихлорфенолиндофенола R. Через 30 секунд после смешивания измеряют светопоглощение с помощью колориметра, используя фильтр с максимумом пропускания при 470 нм, в диапазоне пропускания от 450 до 520 нм. Содержание аскорбиновой кислоты вычисляют из стандартной кривой,

которую получают аналогичной обработкой подходящих объемов

свежеприготовленного раствора аскорбиновой кислоты R в растворе метафосфорной кислоты R концентрацией 25 г/л. Результаты выражают в

миллиграммах на 100 г надпочечной железы. Результат количественного

определения получают с использованием обычных статистических методов.

2.7.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIII

Количественное определение фактора свертывания крови VIII производят по

его биологической активности в качестве кофактора активации фактора Х активированным фактором IX (фактором IХa) в присутствии ионов кальция и

фосфолипидов. Активность препарата фактора VIII оценивают путем сравнения количества, необходимого для достижения определенной скорости образования

фактора Ха в испытуемой смеси, содержащей вещества, принимающие участие в активации фактора Х, и количества Международного Стандарта или препарата

сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для получения такой же скорости образования фактора Ха.

За Международную Единицу принимают активность фактора VIII в

установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного

из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови

VIII. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческий фактор свертывания крови VIII BRP

калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом.

Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии: зависящая от фактора VIII активация фактора Х в реагенте факторов свертывания, состоящем из очищенных компонентов, и

ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с

образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В

соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между

скоростью образования фактора Ха и концентрацией фактора VIII. Содержание метода количественного определения описывается следующей схемой:

В обеих стадиях используются реагенты, доступные из ряда коммерческих

источников. Хотя в состав реагентов могут вноситься некоторые изменения, их

основные свойства должны соответствовать нижеприведенным спецификациям. Отклонения от этого описания допустимы при условии, что с использованием в

качестве препарата сравнения Международного Стандарта концентрата человеческого фактора свертывания крови VIII показано отсутствие существенных различий в результатах.

Коммерчески доступные наборы для количественного определения следует

использовать в соответствии с инструкциями изготовителя; важно убедиться в том,

что используемый набор подходит для данного количественного определения.

РЕАГЕНТЫ

Реагент факторов коагуляции состоит из очищенных белков человеческого

или говяжьего происхождения, включающих фактор Х, фактор IXa и активатор фактора VIII, обычно тромбин. Эти белки подвергнуты частичной очистке, предпочтительно, не менее чем до 50%, и не должны содержать примесей,

мешающих активации фактора VIII или фактора Х. Фактор Х содержится в количествах, приводящих к конечной концентрации на первой стадии определения,

находящейся в пределах 10–350 нмоль/л, предпочтительно 15–30 нмоль/л. Фактор IXa готовят активацией очищенного фактора IX с использованием фактора XIa и получением фактора IXaβ и дальнейшей очисткой фактора IXaβ из реакционной

смеси. Его окончательная концентрация в процессе образования фактора Ха должна

составлять менее 30% от концентрации фактора Х, обычно 1–100 нмоль/л, предпочтительно 1–10 нмоль/л. Тромбин может присутствовать в форме его

предшественника – протромбина, при условии, что его активация в реагенте

протекает с достаточной скоростью для практически мгновенной и полной активации в эксперименте фактора VIII. Фосфолипиды могут быть получены из природных источников, например, из головного или спинного мозга крупного рогатого скота,

соевого экстракта или синтетическим путем, и должны состоять в существенной степени (обычно от 15 до 35%) из фосфатидилсеринов. Окончательная

концентрация фосфолипида в процессе образования фактора Ха должна составлять

1–50 мкмоль/л, предпочтительно 10–35 мкмоль/л. Реагент содержит ионы кальция в количестве, приводящем к окончательной концентрации 5-15 ммоль/л. Образование

конечного фактора Ха проводят в растворе, содержащем не менее 1 мг/мл человеческого или бычьего альбумина, соответствующим образом

буферизированного до рН 7,3–8,0. Компоненты реагента обычно разделяют не менее чем на два отдельных реагента, каждый из которых не обладает способностью самостоятельно генерировать фактор Ха. После восстановления реагенты могут быть объединены при условии, что в отсутствии фактора VIII не

происходит образования существенных количеств фактора Ха. В окончательной инкубационной смеси фактор VIII должен быть единственным компонентом,

лимитирующим скорость.

Вторая стадия включает количественное определение образовавшегося

фактора Ха с использованием специфичного в отношении фактора Ха хромогенного субстрата. Обычно он представляет собой производное короткого пептида,

состоящего из 3–5 аминокислотных остатков, соединенное с хромофорной группой.

При отщеплении этой группы от пептидного субстрата ее хромофорные свойства смещаются к длине волны, при которой становится возможным произвести спектрофотометрическое определение. Субстрат обычно растворяют в воде и используют в концентрациях 0,2–2 ммоль/л. Субстрат также может содержать

подходящие ингибиторы для прекращения дальнейшего образования фактора Ха и супрессирования активности тромбина, что улучшает селективность метода в

отношении фактора Ха.

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Восстанавливают полное содержимое одной ампулы препарата сравнения и испытуемого препарата путем добавления подходящего количества воды R; используют немедленно. К восстановленным препаратам добавляют прерастворитель в количестве, достаточном для получения растворов с содержанием от 0,5 до 2,0 МЕ/мл.

Прерастворитель представляет собой плазму, собранную у пациента,

страдающего острой гемофилией А, или искусственно приготовленный реагент, который приводит к получению результатов, существенно не отличающихся от

результатов, получаемых при использовании гемофилической плазмы и

аналогичных испытуемых и стандартных образцов. Полученные материалы предварительного растворения должны быть стабильны в течение времени, необходимого для проведения определения, т.е. не менее 30 минут при 200С. Их

следует использовать в течение 15 минут.

Готовят дальнейшие разведения испытуемого и стандартного препаратов с

использованием изотонического нехелатирующего буфера, содержащего 1% человеческого или бычьего альбумина и, например, трис-(гидроксиметил)-

аминометан или имидазол, предпочтительно буферизированного при рН от 7,3 до 8,0. Готовят не менее трех отдельных, независимых разведений каждого препарата.

Предпочтительно каждое из разведений готовить в двух повторностях. Разведения готовят таким образом, чтобы окончательная концентрация фактора VIII на стадии образования фактора Ха была ниже 0,03 МЕ/мл, предпочтительно ниже 0,01 МЕ/мл.

Готовят контрольный раствор, включающий все компоненты, кроме фактора

VIII.

Все разведения готовят в пластиковых пробирках и используют незамедлительно.

1-я стадия. Предварительно нагретые разведения образца сравнения

фактора VIII и испытуемого препарата смешивают с соответствующим объемом

предварительно нагретого реагента факторов свертывания крови или со смесью

реагентов, его составляющих, и инкубируют смесь в пластиковых пробирках или ячейках планшета при температуре 370С. Концентрации компонентов в процессе

образования фактора Ха должны соответствовать спецификациям, приведенным выше при описании реагентов. Активацию фактора Х проводят в течение подходящего промежутка времени, предпочтительно прерывая реакцию до

достижения концентрацией фактора Ха ее максимального уровня с целью получения

удовлетворительной линейной зависимости отклика от дозы. Время активации выбирается также таким образом, чтобы достичь линейного во времени образования

фактора Ха. Подходящие периоды активации обычно находятся в пределах от 2 до 5 минут, но допускаются и другие значения, при условии получения таким образом

лучшей линейности зависимости отклика от дозы.

2-я стадия. Активацию прерывают добавлением предварительно нагретого реагента, содержащего хромогенный субстрат. Проводят количественную оценку скорости расщепления субстрата, которая должна находиться в линейной зависимости от концентрации образовавшегося фактора Ха, измеряя изменение

оптической плотности при соответствующей длине волны с помощью спектрофотометра. Оптическую плотность отслеживают постоянно, получая таким

образом возможность вычислить начальную скорость расщепления субстрата, либо

прерывают реакцию гидролиза по окончании подходящего промежутка времени

путем понижения рН добавлением подходящего реагента, например, уксусной

кислоты (50 объемных процентов С2Н4О2) или раствора цитрата (1 моль/л) с рН 3.

Время гидролиза регулируют с целью достижения линейного характера образования хромофора во времени. Подходящими обычно являются периоды гидролиза от 3 до 15 минут, но допускаются и другие значения при условии получения таким образом лучшей линейности зависимости отклика от дозы.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого

препарата с использованием обычных статистических методов (например, 5.3.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).

2.7.5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕПАРИНА

Антикоагулянтную активность гепарина определяют in vitro путем сравнения

его способности в заданных условиях замедлять свертывание обогащенной кальцием и цитратом овечьей плазмы с аналогичной способностью препарата

сравнения гепарина, калиброванного в Международных Единицах.

Международная Единица (МЕ) – активность, проявляемая установленным

количеством Международного стандарта, состоящего из высушенной из замороженного состояния натриевой соли гепарина, полученной из свиных

кишечных слизистых оболочек. Эквивалент Международного стандарта в МЕ устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец гепарина натриевой соли BRP калибруют в МЕ по

сравнению с Международным стандартом с использованием изложенной ниже методики количественного определения.

Количественное определение выполняют одним из следующих методов

установления начала свертывания с использованием пробирок и другого оборудования, соответствующего выбранному методу:

а) прямое визуальное наблюдение, предпочтительно, в отраженном свете на черном матовом фоне;

b) спектрофотометрическая регистрация изменения оптической плотности при длине волны около 600 нм;

с) визуальная фиксация изменения текучести путем производимого вручную опрокидывания пробирок;

d) механическая запись изменения текучести, определяемого по перемешиванию, с соблюдением мер предосторожности, направленных на минимизацию возмущений

раствора в начальной стадии свертывания.

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Приведенные в тексте объемы являются примерными и могут быть адаптированы к используемой аппаратуре при условии соблюдения соотношений

между различными объемами.

Стандартный образец гепарина натриевой соли BRP разбавляют раствором натрия хлорида R концентрацией 9 г/л до получения точно известного количества МЕ в миллилитре, и готовят аналогичный раствор испытуемого препарата, для

которого ожидается такая же активность. Используя раствор натрия хлорида R

концентрацией 9 г/л, из каждого раствора готовят ряд разведений в геометрической прогрессии так, чтобы время свертывания, получаемое для низшей концентрации,

не менее чем в 1,5 раза превышало время в контрольном опыте, а время

свертывания, получаемое для высшей концентрации, давало значение, приводящее

к построению удовлетворительной логарифмической кривой зависимости отклика от дозы, что определяется в ходе предварительного испытания.

Помещают двенадцать пробирок в баню с ледяной водой. Помечают их следующим образом: два ряда (Т1, Т2, Т3) для разведений испытуемого препарата и два ряда (S1, S2, S3) для разведений препарата сравнения. В каждую из пробирок

помещают по 1,0 мл размороженного субстрата плазмы R1 и 1,0 мл

соответствующего разведения испытуемого препарата или препарата сравнения. После каждого из добавлений производят перемешивание, не допуская

образования пузырьков. Для дальнейших манипуляций пробирки отбирают в

порядке: S1, S2, S3, Т1, Т2, Т3. Каждую из пробирок приблизительно на 15 минут

помещают в водяную баню, нагретую до температуры 370С, и добавляют к каждой из

них 1 мл разведения цефалина R, к которому был добавлен соответствующий

активатор, например, каолин, таким образом, чтобы время контрольного опыта было подходящим и не превышало 60 секунд. При использовании каолина

непосредственно перед проведением испытания готовят смесь равных объемов цефалина R и суспензии легкого каолина R с его содержанием 4 г/л в растворе

натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Ровно через 2 минуты добавляют 1 мл раствора кальция хлорида R концентрацией 3,7 г/л и регистрируют в качестве

времени свертывания интервал, в секундах, между последним добавлением и началом свертывания, определяемым с помощью выбранного метода. В начале и в

конце процедуры аналогичным образом определяют время контрольного опыта, используя вместо одного из разбавлений гепарина 1 мл раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л; два полученных контрольных значения не должны существенно

различаться. Времена свертывания переводят в логарифмы, используя средние

значения для дублирующихся пробирок. Процедуру повторяют со свежими

разведениями, проводя инкубации в порядке: Т1, Т2, Т3, S1, S2, S3. Результаты

вычисляют с использованием обычных статистических методов.

Проводят не менее трех независимых определений. Для каждого из таких

определений готовят свежие растворы препарата сравнения и испытуемого препарата, и используют новую свежеразмороженную порцию субстрата плазмы.

Активность испытуемого препарата вычисляют путем комбинирования результатов этих определений с использованием обычных статистических методов. Если отклонение, вызванное различиями между результатами определений, является значительным при Р = 0,01, комбинированная оценка активности может

быть получена путем вычисления простого среднего значения оценок активности.

# Количественное определение гепарина в субстанции и готовых

лекарственных формах может быть выполнено с использованием реакции антикоагуляции в соответствии с нижеизложенным методом.

Антикоагулянтная активность. Определение активности гепарина проводят

биологическим методом по способности его задерживать свертывание нитратной

бараньей или бычьей плазмы, путем сопоставления активности испытуемого препарата с активностью гепарина - стандартного образца.

В два ряда тщательно вымытых и высушенных пробирок вносят возрастающее количество рабочих растворов стандартного образца гепарина,

испытуемого препарата гепарина и раствора натрия хлорида изотонического 0,9 % в

количествах, указанных в таблице. После этого в каждую пробирку прибавляют по 1 мл плазмы, затем по 0,2 мл рабочего раствора кальция хлорида (попеременно в

пробирки из ряда с раствором стандартного образца гепарина и испытуемого

препарата гепарина), смешивают содержимое осторожно, поворачиванием и легким встряхиванием, не допуская образования пузырей, отмечают время и оставляют при комнатной температуре (или в термостате при температуре 37°С) на 1 ч. По

истечении указанного времени определяют состояние плазмы в каждой пробирке и отмечают в каждом ряду крайнюю слева пробирку, в которой не произошло полное свертывание плазмы.

Эти пробирки содержат наименьшие объемы растворов стандартного образца

гепарина и испытуемого препарата гепарина, которые задерживают свертывание плазмы.

Антикоагулянтную активность (Х) препарата, в ЕД/мл, вычисляют по формуле:

X= V1 × A ,

V2

где

V1 - наименьший объем раствора стандартного образца гепарина, задерживающий свертывание плазмы, в миллилитрах;