Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

племента (Таблица 2.6.17.-2). Антикомплементарную активность испытуемого

препарата вычисляют относительно контроля комплемента, принимаемого за 100%, по формуле:

b- активность комплемента, в СН50/мл, в испытуемом образце.

Результаты испытания считают достоверными, если

-антикомплементарные активности, определенные для АКА- отрицательного и АКА-положительного контролей находятся в пределах, указан- ных в листке-вкладыше, сопровождающем стандартный образец,

-активность комплемента в контроле комплемента (а) находится в преде- лах от 80 до 120 СН50/мл.

2.6.18. ИСПЫТАНИЕ ЖИВЫХ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН НА НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТЬ

В каждом испытании используют не менее десяти серонегативных по отно- шению к испытуемому вирусу обезьян. Каждой из обезьян в таламический отдел каждого полушария вводят не менее 0,5 мл испытуемого материала, если иное не

предписано в частной статье. Общее количество привитого каждой обезьяне ви-

руса не должно быть менее количества, содержащегося в рекомендованной еди- ничной человеческой дозе вакцины. Для проверки наличия диких нейровирулент-

ных вирусов контрольную группу, состоящую не менее чем из четырех обезьян,

содержат в тех же клетках, что и группу привитых обезьян, или в непосредствен- ной близости от них. Привитых обезьян наблюдают в течение 17–21 дней, отме- чая возникновение паралича и других неврологических симптомов; обезьян из контрольной группы наблюдают в течение того же периода и дополнительно 10 дней. Животные, погибшие в течение первых 48 часов после инъекции, считаются погибшими по причинам неспецифического характера и могут быть заменены дру-

гими. Результаты испытания признают недостоверными, если: более 20% приви- тых обезьян погибают по неспецифическим причинам; образцы сыворотки, ото- бранные у обезьян контрольной группы, в момент прививки испытуемых животных

и через 10 дней после умерщвления последних, имеют признаки инфекции, вы- званной диким вирусом испытуемого типа или вирусом кори. По окончании перио- да наблюдения выполняют вскрытие и гистопатологическое изучение соответст-

вующих отделов мозга на предмет наличия воздействия на центральную нервную

систему. Материал выдерживает испытание, если не обнаруживается неожидан-

ных клинических и гистопатологических признаков воздействия на центральную

нервную систему, которые могут быть вызваны введенным вирусом.

2.6.19. ИСПЫТАНИЕ ПЕРОРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПОЛИОМИЕЛИТА НА НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТЬ

Обезьяны, используемые в испытании на нейровирулентность, должны со-

ответствовать требованиям, приведенным в частной статье «Вакцина полиомие- лита, пероральная (0215)» и иметь массу тела не менее 1,5 кг. Патогенность для

обезьян семейств Macaca или Cercopithecus испытывается в сравнении с патоген-

ностью стандартного вирусного препарата для испытания на нейровирулентность

путем введения в поясничный отдел центральной нервной системы после седа- ции с использование подходящего агента, например, гидрохлорида кетамина. Для образца сыворотки, отобранного до инъекции, должно быть показано отсутствие нейтрализующих антител в разведении 1:4 при испытании против не более, чем

1000 CCID50 каждого из трех типов полиовируса.

Количество обезьян. Вакцину и подходящий гомотипический вирус срав-

нения испытывают одновременно в одной и той же группе обезьян. Вакцину и препарат сравнения вводят равному количеству животных. Животных с разли-

чающимися типами введенного препарата размещают случайным образом по клеткам, а их принадлежность кодируется таким образом, чтобы тип полученной

ими прививки был скрыт от наблюдателей. Количество привитых обезьян должно быть таково, чтобы при оценке как вакцины, так и препарата сравнения было включено не менее одиннадцати обезьян, положительных по отношению к вирусу типов 1 и 2, и не менее восемнадцати обезьян, положительных по отношению к вирусу типа 3 (положительными считают обезьян, имеющих специфические ней-

ронные повреждения, вызванные полиовирусом в центральной нервной системе). С одним и тем же гомотипическим стандартом могут испытываться несколько пар-

тий вакцины. По возможности, используют обезьян из одной и той же карантинной

группы. В других случаях используют обезьян из двух групп, причем вакцина и препарат сравнения прививаются равному количеству обезьян из каждой группы. Если испытание проводится в течение двух рабочих дней, в каждый из дней вак-

циной и гомотипическим препаратом сравнения прививают равное количество обезьян.

Содержание вируса. Содержание вируса в вакцине и гомотипическом пре-

парате сравнения регулируют таким образом, чтобы они были насколько возмож-

но близки и находились в пределах от 105.5 до 106.5 CCID50 в 0,1 миллилитре.

Наблюдение. Всех обезьян наблюдают в течение 17–22 дней, отмечая

признаки полиомиелита или других вирусных инфекций. Обезьян, выживших в те-

чение первых 24 часов, но погибших до 11-го дня после прививки, подвергают вскрытию для определения того, являлся ли причиной гибели полиомиелит. Жи- вотные, погибшие по причинам, не связанным с полиомиелитом, не учитываются

при оценке результатов. Умирающих и в тяжелой степени парализованных живот- ных умерщвляют и вскрывают. Также вскрывают всех животных, выживших в те-

чение периода наблюдения. Результаты испытания считают недостоверными, ес- ли более, чем у 20% животных в течение периода наблюдения была обнаружена

интеркуррентная инфекция.

Количество срезов, подлежащих испытанию. Гистологическому иссле-

дованию подлежат, как минимум, поясничный и шейный отделы, верхний и ниж- ний продолговатый мозг, средний мозг, зрительный бугор и двигательная область коры головного мозга каждой обезьяны. Отбирают препараты толщиной 15 мкм и окрашивают их галлоцианином. Минимальные количества подлежащих испыта-

нию срезов составляют:

(а) 12 срезов, репрезентативных для поясничного утолщения,

(b)10 срезов, репрезентативных для шейного утолщения,

(c)2 среза продолговатого мозга,

(d)1 срез моста и мозжечка,

(e)1 срез среднего мозга,

(f)1 срез с левой и правой части зрительного бугра,

(g)1 срез с левой и правой части двигательной области коры головного мозга.

Подсчет вирусной активности. Для оценки вирусной активности в полу-

секциях поясничного корда и ствола мозга используют систему подсчета тяжести повреждений, по которой следующим образом дифференцируют клеточную ин- фильтрацию и разрушение нейронов:

1.Наличие лишь клеточной инфильтрации (обезьяна не считается положи-

тельной),

2.Клеточная инфильтрация с минимальным повреждением нейронов,

3.Клеточная инфильтрация со значительным повреждением нейронов,

4.Массовое повреждение нейронов в сочетании или без клеточной инфильт- рации.

Полученные значения записывают на стандартном бланке (пример подхо- дящей формы имеется в разделе «Требования к вакцине полиомиелита (перо- ральной)» в Требованиях к биологическим субстанциям №7 Всемирной организа-

ции здравоохранения). Обезьяна, на срезах тканей которой имеются поврежден-

ные нейроны, но не имеется игольчатых трактов, считается положительной. Обезьяна, на срезах тканей которой имеются игольчатые тракты, но не имеется

поврежденных нейронов, не считается положительной. Срезы, на которых имеют-

ся повреждения травматического происхождения, но не имеется специфических вирусных повреждений, при подсчете не учитываются.

Уровни тяжести повреждений основаны на данных, полученных при изуче- нии полусекций поясничных (L), шейных (C) и мозговых (B) гистологических сре- зов. Для каждой положительной обезьяны рассчитывают уровень повреждений (LS) по формуле

Для каждой группы положительных обезьян рассчитывают среднее значе-

ние уровня повреждений.

Оценка. Сравнение вирусной активности в вакцине и в препарате сравне- ния основано на активности в поясничном расширении корда и степени распро-

странения активности из этого региона в шейное расширение и головной мозг.

Положительное или отрицательное решение основано на общем уровне для всех животных, подвергнутых испытанию. Необычно высокая активность как в пояснич-

ном отделе, так и в результате распространения из этого региона, обнаруженная у отдельных животных, также должна приниматься во внимание при вынесении окончательного решения. Моновалентный материал выдерживает испытание, ес-

ли имеется требуемое количество положительных животных и если ни в одном из клинических и гистопатологических исследований не выявлено существенных различий в патогенности между вирусом вакцины и препаратом сравнения. Кри- терии положительного решения приведены ниже.

Критерии. Для каждой из вакцин сравнения (типов 1, 2 и 3) проводят под-

ходящее количество (например, четыре) квалификационных испытаний на виру- лентность с целью получения данных об активности этих вакцин как основы кри-

териев для оценки испытуемых вакцин. Для повторных испытаний каждого из стандартных вирусов вычисляют общий средний уровень повреждений (М), а так-

же суммарную оценку дисперсии (s2) и отклонения (s) результатов испытания.

Критерии достоверности результатов испытания препарата сравнения ус- танавливаются на основе данных, накопленных в квалификационных испытаниях. Общепринятых критериев не имеется; для лабораторий с ограниченным опытом

работы может быть полезен следующий эмпирический метод установления до- пустимых пределов среднего уровня повреждений для препарата сравнения (Xref):

Если средний уровень повреждений испытуемой вакцины равен Xtest, а C1,

C2 и C3 – константы, определенные ниже, то:

Вакцина не выдерживает испытание при:

Xtest - Xref > C1

Вакцина может быть однократно подвергнута повторному испытанию при:

C1 < Xtest - Xref < C2

Если вакцина испытывается повторно, средние значения уровней повреж- дений для испытуемой вакциной и препаратом сравнения рассчитываются заново.

Вакцина не выдерживает испытание при:

2.6- нормальное отклонение для 0,5% уровня,

1.6нормальное отклонение для 5% уровня.

Испытание на нейровирулентность, в котором получен средний уровень по-

вреждений препарата сравнения (Xref), несовместимый с предшествующим опы- том, не используется для оценки испытуемой вакцины. Если результаты испыта-

ния достоверны, вычисляют средний уровень повреждений для испытуемой вак- цины (Xtest) и сравнивают его с соответствующим значением для гомотипической

стандартной вакцины.

2.6.20. АНТИ-А И АНТИ-В ГЕМАГГЛЮТИНИНЫ (НЕПРЯМОЙ МЕТОД)

Готовят два серийных разведения испытуемого препарата в растворе на-

трия хлорида R концентрацией 9 г/л. К каждому разведению одного ряда добав- ляют равный объем суспензии эритроцитов группы А1 концентрацией 5 объемных процентов, предварительно трижды промытых раствором натрия хлорида. К каж-

дому разведению другого ряда добавляют равный объем суспензии эритроцитов группы В концентрацией 5 объемных процентов, предварительно трижды промы-

тых раствором натрия хлорида. Суспензии инкубируют при температуре 370С в течение 30 минут, затем клетки трижды промывают раствором натрия хлорида. Клетки оставляют в контакте с поливалентным антиреагентом человеческого им-

муноглобулина в течение 30 минут. Каждую из суспензий, не подвергая центрифу- гировангию, исследуют под микроскопом на агглютинацию.

2.6.21. МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. ВВЕДЕНИЕ

Методы амплификации нуклеиновых кислот основаны на двух различных подходах:

1.Амплификация последовательности-мишени нуклеиновой кислоты с ис- пользованием, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной реакции (ЛЦР) или изотермической амплификации рибонуклеиновой кислоты

(РНК).

2.Амплификация сигнала гибридизации с использованием, например, для

дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) метода разветвленной ДНК (bDNA). В этом случае амплификация сигнала достигается без подвергания нуклеиновой ки-

слоты повторяющимся циклам амплификации.

Вданном общем разделе в качестве стандартного метода описывается ме-

тод ПЦР. Могут применяться и альтернативные методы, если они выдерживают требования к качеству, перечисленные ниже.

2.ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Вданном разделе устанавливаются требования к подготовке образца, к ам- плификации in vitro последовательностей ДНК и к детектированию специфическо- го продукта ПЦР. С помощью ПЦР могут быть детектированы определенные по-

следовательности ДНК. Последовательности РНК могут также быть детектирова- ны путем обратной транскрипции РНК на комплементарную ДНК (cDNA) с после- дующей амплификацией.

3.ПРИНЦИП МЕТОДА

ПЦР представляет собой процедуру, позволяющую производить в условиях in vitro амплификацию сегментов ДНК или РНК (после обратной транскрипции на cDNA).

После денатурации двунитевой ДНК в однонитевую два синтетических оли- гонуклеотидных праймера противоположной полярности спариваются с их соот-

ветствующими комплементарными последовательностями в подлежащей ампли- фикации ДНК. Короткие двунитевые участки, формирующиеся в результате спе- цифического спаривания оснований праймеров и комплементарной ДНК- последовательности, образуют границы амплифицируемого сегмента ДНК и слу-

жат начальными точками для синтеза ДНК in vitro с участием термостабильной ДНК-полимеразы.

Процесс амплификация ДНК состоит из циклов, включающих:

-тепловую денатурацию нуклеиновой кислоты (последовательности-мишени) на

две отдельные нити;

-специфический отжиг последовательности-мишени с праймерами в подходящих

реакционных условиях;

-наращивание праймеров, присоединенных к обеим отдельным нитям, под воз-

действием ДНК-полимеразы при подходящей температуре (синтез ДНК).

Повторяющиеся циклы тепловой денатцурации, отжига с праймерами и

синтеза ДНК приводят к экспоненциальной амплификации сегмента ДНК, ограни-

ченного праймерами.

Специфический продукт ПЦР, называемый ампликоном, может быть опре-

делен разнообразными методами соответствующей специфичности и чувстви-

тельности.

4.ИСПЫТУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ

Всвязи с высокой чувствительностью ПЦР, образцы должны быть опти- мальным образом защищены от попадания извне последовательностей-мишеней. Отбор проб, хранение и транспортировку испытуемого материала производят в условиях, минимизирующих деградацию последовательности-мишени. В случае

проведения испытания на РНК-последовательности, необходимо принять особые

меры предосторожности ввиду высокой чувствительности РНК к деструктивному воздействию рибонуклеаз. Следует учитывать, что некоторые добавляемые реа-

генты, например, антикоагулянты или консерванты, могут оказывать влияние на

ход определения.

5.МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

5.1. Предотвращение загрязнения

Всвязи с риском загрязнения следует строго разграничивать рабочие зоны

взависимости от используемых материалов и применяемой технологии. Учиты-

ваемые факторы включают передвижение персонала, использование спецодеж- ды, перемещение материалов, подачу воздуха и процедуры деконтаминации.

Систему следует разделить на такие отсеки, как:

-зона основной смеси (зона, в которой работы осуществляются только с материа- лами, не содержащими шаблонных последовательностей, например, праймерами, буферными растворами и т.д.),

-пре-ПЦР (зона, в которой ведется работа с реагентами, образцами и контроля-

ми),

-ПЦР-амплификация (амплифицируемый материал содержится в закрытой сис-

теме),

-пост-ПЦР детектирование (единственная зона, в которой операции с амплифи-

цируемым материалом производятся в открытой системе).

5.2Подготовка образцов

При подготовке образцов подлежащая амплификации последовательность-

мишень должна быть эффективным и воспроизводимым образом экстрагирована или высвобождена из испытуемого материала так, чтобы амплификация в из- бранных реакционных условиях была осуществима. Могут быть использованы

различные физико-химические процедуры экстракции и/или обогащения.

Добавки, присутствующие в испытуемом материале, могут оказывать влия-

ние на ход ПЦР. Для контроля присутствия ингибиторов в испытуемом материале следует провести процедуры, описанные в пункте 7.3.2.

В случае РНК-матриц следует уделять внимание предотвращению прояв- ления рибонуклеазной активности.

5.3 Амплификация

Амплификация последовательности-мишени методом ПЦР проводится в опти- мизированных циклически изменяющихся условиях (температурный профиль для денатурации двунитевой ДНК, отжига и наращивания праймеров; периоды инку-

бации при выбранных температурах; скорость наращивания). Эти условия зависят

от различных параметров, например:

-длины и состава праймера и последовательности-мишени;

-типа ДНК-полимеразы, буферной смеси и реакционного объема, используемых

при амплификации;

-типа используемого устройства для термоциклирования и скорости передачи тепла между аппаратом, реакционным сосудом и реакционной жидкостью.

5.4 Детектирование

Ампликон, образовавшийся в результате ПЦР, может быть идентифицирован по размеру, последовательности, путем химической модификации или комбина-

цией этих методов. Характеризация по размеру может быть проведена методами

гель-электрофореза (с использованием слоев агарозного или полиакриламидного гелей или капиллярного электрофореза) или колоночной хроматографии (напри-

мер, ВЭЖХ). Характеризация по составу последовательности может быть прове-

дена путем специфической гибридизации зондов, содержащих последователь- ность, комплементарную мишени, или расщеплением амплифицированного мате- риала, отражающим наличие мишень-специфических сайтов ферментативной ре-

стрикции. Характеризация по химической модификации может быть проведена, например, введением в ампликоны флуорофора с дальнейшей детекцией флуо-

ресценции, возникающей в результате возбуждения. 6. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результат испытания является достоверным лишь при условии получе-

ния однозначно положительных результатов для положительного контроля (контролей) и однозначно отрицательных результатов для отрицательного контроля (контролей). В связи с исключительно высокой чувствительностью метода ПЦР и с риском попадания загрязняющих примесей, положительные ре- зультаты должны подтверждаться двукратным полным повторением проце-

дуры испытания, по возможности, с новой аликвотой образца. Считают, что

образец дает положительную реакцию, если не менее одного из повторных ис- пытаний дает положительный результат.

7.ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА

7.1Валидация системы для количественного определения методом

ПЦР.

Программа валидации должна включать валидацию оборудования и ис- пользуемого метода ПЦР. Следует учитывать положения, изложенные в руково- дстве ICH (тема Q2B) «Валидация аналитического метода: методология».

Для валидации ПЦР-испытания обязательным является применение

официальных рабочих стандартных образцов или стандартных препаратов

внутреннего применения, калиброванных относительно Международных Стан- дартов, для последовательностей-мишеней, для определения которых систе-

ма будет использоваться.

При валидации должно быть определено положительное граничное значе-

ние. Положительное граничное значение определяется как минимальное количе- ство последовательностей-мишеней в объеме образца, которые могут быть опре-

делены в 95% испытаний. Положительное граничное значение зависит от таких взаимосвязанных факторов, как объем экстрагированного образца и эффектив-

ность методологии экстракции, транскрипция РНК-мишени в cDNA, процесс ам-

плификации и детекции.

При определении предела детекции системы следует учитывать положи-

тельные граничные значения для каждой последовательности-мишени и резуль-

таты проведения испытания выше и ниже этих значений.

7.2. Контроль качества реагентов.

Все реагенты, имеющие критическое значение для используемой методоло- гии, должны проходить контроль перед использованием в рутинных испытаниях. Их пригодность или непригодность основывается на заранее определенных кри- териях качества.

Праймеры являются важнейшими компонентами ПЦР-анализа, и поэтому

следует уделять особое внимание их строению, чистоте и валидации для ПЦР- анализов. Каждая новая партия праймеров перед введением в испытание должна

быть испытана на специфичность, эффективность амплификации и отсутствие ин-

гибирующих примесей. Праймеры могут быть подвергнуты модификации (напри- мер, связыванием с флуорофором или антигеном) для проведения детекции ам- пликона специфическими методами при условии, что такие модификации не при-

ведут к ингибированию правильного и эффективного протекания процесса ам- плификации последовательности-мишени.

7.3. Контроль хода испытания.

7.3.1. Внешние контроли.

Для минимизации риска загрязнения и обеспечения адекватной чувствитель- ности в состав каждого ПЦР-испытания вводят следующие внешние контроли:

-положительный контроль: в нем содержится определенное количество копий последовательности-мишени; количество копий определяется индивидуально

для каждой системы и кратно положительному граничному значению данной системы;

-отрицательный контроль: образец аналогичного основного состава, для кото-

рого доказано отсутствие последовательностей-мишеней. 7.3.2. Внутренний контроль.

Внутренние контроли представляют собой определенные последовательности нуклеиновых кислот, содержащие сайты связывания с праймерами. Внутренние

контроли должны амплифицироваться так же эффективно, как и испытуемая по- следовательность-мишень, но ампликоны должны иметь четкие отличия. Тип нук- леиновой кислоты (ДНК/РНК), используемой в качестве внутреннего контроля, должен быть тем же, что и в испытуемом материале. Внутренний контроль пред-

почтительно добавлять к испытуемому материалу до выделения нуклеиновой ки- слоты; при этом он может использоваться для общего контроля процесса (экс-

тракция, обратная транскрипция, амплификация, детекция).

7.4. Внешняя оценка качества

Участие во внешних программах оценки качества представляет собой важную процедуру обеспечения качества ПЦР-анализов для каждой лаборатории и каждо-

го оператора.

Следующий раздел приводится для информации.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (МАНК) В ОПРЕДЕЛЕНИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С (HCV) В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ: РУКОВО-

ДСТВО

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Большинство аналитических методик, основанных на амплификации нук-

леиновых кислот, представляют собой качественные испытания на наличие нук-

леиновых кислот. Существует также некоторое количество методик количествен- ного определения (либо внутренних, либо коммерчески доступных). Для опреде- ления загрязнения пулов плазмы РНК HCV адекватными являются качественные тесты, которые могут быть рекомендованы как предельные испытания при кон- троле содержания примесей, в соответствии с указаниями в Техническом руково- дстве по разработке монографий «Pharmeuropa», декабрь 1999, глава III «Вали-

дация аналитических методик». В этом руководстве описаны лишь методы вали-

дации качественных аналитических методик оценки загрязнения пулов плазмы РНК HCV на основе амплификации нуклеиновых кислот. Поэтому двумя наиболее

важными характеристиками для валидации аналитического метода являются его

специфичность и предел детекции. Кроме того, должна быть оценена устойчи-

вость аналитического метода.

Однако этот документ также может быть использован в качестве ос-

новы для валидации амплификации нуклеиновых кислот в общем.

Для целей данного документа, за аналитическую процедуру принимают всю

процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детекции амплифицированного продукта.

При использовании в аналитическом методе или его части коммерческого набора, валидацию пользователя может заменить документированное подтвер- ждение валидации вышеуказанных положений, произведенной изготовителем на- бора. Тем не менее, пользователем должна быть продемонстрирована произво- дительность набора в отношении его предполагаемого использования (т.е. пре- дел детекции, устойчивость, перекрестная контаминация).

2. СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Специфичность представляет собой способность к однозначной оценке

присутствия нуклеиновой кислоты в смеси с компонентами, присутствие которых можно ожидать.

Специфичность аналитических методов, основанных на амплификации нук- леиновых кислот, зависит от выбора праймеров, выбора зонда (для анализа ко-

нечного продукта) и обоснованности условий проведения испытания (как для ста- дии амплификации, так и для стадии детекции).

При разработке праймеров и зондов должна быть исследована их специ- фичность в отношении детектирования только РНК HCV путем сравнения избран-

ной последовательности с последовательностями, опубликованными в банках данных. В случае HCV праймеры (и зонды) обычно выбирают из областей 5’-

некодируемого участка генома HCV, которые хорошо сохраняются для всех гено- типов.

Амплифицированный продукт должен однозначно идентифицироваться од- ним из многих методов, например, проведением амплификации с вложенными

праймерами, анализ с использованием ферментов рестрикции, секвенирование или гибридизация со специфическим зондом.

Для валидации специфичности аналитического метода испытание должно

быть проведено в отношении не менее 100 РНК HCV-отрицательных пулов плаз-

мы, для которых должно быть показано отсутствие реакции. Подходящие образцы

пулов, не дающих реакции, могут быть получены в Европейском директорате по качеству медицинских препаратов.

Способность аналитического метода к детекции всех генотипов HCV также

зависит от выбора праймеров, зондов и параметров метода. Эта способность должна быть продемонстрирована с использованием характеризованных эталон- ных панелей. Однако, ввиду сложности получения некоторых генотипов (напри- мер, генотипа 6), должны быть на подходящем уровне детектированы генотипы преобладающих типов (например, в Европе – генотипы 1 и 3).

3. ПРЕДЕЛ ДЕТЕКЦИИ

За предел детекции данной аналитической процедуры принимают наи-

меньшее количество нуклеиновой кислоты в образце, которое может быть детек- тировано, но не обязательно определено как точное значение. Аналитический ме-

тод с использованием амплификации нуклеиновых кислот, используемый для де-

текции РНК HCV в пулах плазмы, обычно дает качественные результаты. Количе- ство возможных результатов ограничено двумя: либо положительным, либо отри- цательным. Хотя рекомендуется определение предела детекции, в практических

целях для аналитического метода на основе амплификации нуклеиновых кислот должно быть определено положительное граничное значение. Положительное

граничное значение (в соответствии с определением в общем разделе 2.6.21) представляет собой минимальное количество последовательностей-мишеней в

объеме образца, которые могут быть определены в 95% испытаний. На это поло- жительное граничное значение оказывают влияние распределение вирусных ге-

номов в индивидуальных испытуемых образцах и такие факторы, как эффектив- ность фермента. Это может привести к получению различных 95% граничных зна-

чений для отдельных испытаний.

Для определения положительного граничного значения ряд разведений ра- бочего реагента или стандартного образца вируса гепатита С BRP, калиброван-

ного в сравнении с Международным Стандартом HCV ВОЗ 96/790, должен быть

подвергнут испытанию в разные дни для проверки изменчивости результатов