Иммунохимические методы в скрининге лекарственных веществ. Иммунохимический анализ (иха)

Современные иммунохимические методы анализа лекарственных средств и наркотических веществ отличаются такими особенностями, как высокая чуствительность, специфичность, экспрессность, простота исполнения. Реакция проводится прямо в биожидкости, поэтому не требуется применять изолирование и дополнительную очистку. Методы ИХА позволяют одновременно анализировать большое число проб, поэтому они очень удобны для скрининг-диагностики.

В то же время, широкое применение этих методов сдерживается тем, что для них требуются особые реагенты (особо чистые сыворотки, ферменты), которых отечественная промышленность не производит.

В основе всех методов ИХА лежит специфическая реакция «антиген – антитело», где антигеном является определяемое вещество, чужеродное для организма. При введении в живой организм чужеродного соединения (антигена АГ) образуются антитела АТ, которые сразу связываются с антигеном. Образующийся комплекс (АГ+АТ) выпадает в осадок. Реакция взаимодействия (АГ+ АТ) является специфичной и протекает количественно, что и используется в анализе.

Для детектирования результатов реакции один из компонентов (антиген или антитело) метят специальной меткой. В зависимости от природы метки и способа ее детектирования выделяются различные виды ИХА:

Метод	Способ детектирования
Радиоиммунный анализ (РИА)	Радиоактивность
Иммуноферментный (энзимный) анализ (ИФА)	Ферментная активность
Поляризационный флюороиммуно-анализ (ПФИА)	Интенсивность флюоресцентной поляризации
Люминесцентный иммуноанализ (ЛИА)	Интенсивность люминесценции

Существует и ряд других методов.

Наибольшее распространение в химико-токсикологическом анализе лекарственных и наркотических веществ получили РИА и ИФА:

1. радиоиммунный метод (РИА)

2. иммуноэнзимный метод (ИФА)

В ИФА в качестве метки для антигенов ( т.е.определяемых веществ) используются ферменты. Как правило, это различные оксидазы, способные окислять специальное химическое вещество – хромогенный субстрат- с образованием окрашенных продуктов. По интенсивности окраски и судят о количестве искомого вещества.

В РИА используется аналогичный принцип, только в качестве метки используется радиоактивный изотоп. Измеряя радиоактивность выделившегося изотопа, определяют количественное содержание искомого вещества.

Производные барбитуровой кислоты в химико-токсикологическом отношении

Из лекарственных веществ, экстрагируемых органическим растворителем из кислого раствора, наибольшее токсикологическое значение имеют производные барбитуровой кислоты. Эта группа веществ подлежит обязательному судебно-химическому исследованию при проведении общего судебно-химического анализа (Приказ МЗ СССР . №1021 от 25.12.73 г.).

Первый из барбитуратов – барбитал- синтезирован в 1881 г. В медицинскую практику производные барбитуровой кислоты были введены в 1903 г. Фишером и Мерингом. В настоящее время синтезировано около 2500 производных, из которых в нашей стране применяется 11.

Токсикологическое значение производных барбитуровой кислоты очень велико. С одной стороны, барбитураты обладают высокой фармакологической активностью, поэтому их передозировка может привести к различным осложнениям и даже вызвать смертельный исход. С другой - они достаточно доступны для населения, т.к. широко используются в медицинской практике в качестве снотворных, седативных, противосудорожных средств. В технике и в фотографии применяются как ингибиторы и антиоксиданты, в химических лабораториях как реактивы. При длительном применении они вызывают пристрастие и привыкание, т.е. барбитуровую токсикоманию и наркоманию (барбамил и этаминал-натрий официально отнесены к наркотическим средствам). Все эти факторы приводят к тому, что производные барбитуровой кислоты занимают одно из первых мест по количеству вызываемых ими отравлений.

В основе химического строения барбитуратов лежит кольцо малонилмочевины, или барбитуровой кислоты, которая может быть получена при взаимодействии мочевины и диэтилового эфира малоновой кислоты.

малонилмочевина

(2,4,6-триоксипиримидин)

Барбитуровая кислота является циклическим уреидом и может рассматриваться как производное пиримидина (2,4,6 - триоксипиримидин). Атомы водорода метиленовой группы в 5-ом положении пиримидинового кольца, а также водород, стоящий у атомов азота в 1-ом и 3-ем положениях, подвижны и способны замещаться различными органическими радикалами, атом кислорода в положении 2 также способен замещаться на атом S. На этих свойствах и основан синтез производных барбитуровой кислоты.

Общую формулу барбитуратов можно изобразить следующим образом:

где R1,R2,R3 - радикалы, содержащие от 1 до 7 атомов углерода. В зависимости от заместителей в 1(3) и 5 положениях пиримидинового кольца, а также наличия во 2-ом положении атома О и S все барбитураты можно разделить на 3 группы:

1) 5,5 -замещенные производные (двузамещенные), из которых наиболее часто применяются:

1. Барбитал R₁ и R₂ - C₂H₅

2. Фенобарбитал R₁ - C₂H₅, R₂ - C₆H₅

СН₃

3. Барбамил R₁ -C₂H₅, R₂ - CH₂ - СН₂ - СН

СН₃

4. Этаминал –натрий R₁ - C₂H₅, R₂ – CH - CH₂ - СН₂ – СН₃

CH₃

5. Бутобарбитал R - C₂H₅ , R₂ – C₄ H₉

2. N-замещенные барбитураты (трехзамещенные)

1. Гексенал R₁ – CH₃, R₃ – CH₃

2. Бензонал R₁ - C₂H₅, R₂ - C₆H₅,

CH₃

2. Бензобамил R₁ - C₂H₅, R₂ – CH₂ - CH₂ - CH

CH₃

2. Тиобарбитураты (атом кислорода во 2 положении замещен на атом серы)

1.Тиопентал- натрий R₁- C₂H₅, R₂- CH-CH₂-CH₂-CH-СН₃

По физическим свойствам все интересующие в настоящее время судебно-химическую экспертизу барбитураты представляют собой белые кристаллические вещества без запаха, горького вкуса, лишь тиопентал имеет желтоватый оттенок и обладает слабым запахом серы.

Кислотные /молекулярные/ формы барбитуратов растворимы в эфире, хлороформе, спирте и некоторых других органических растворителях, натриевые производные - в воде.

Барбитураты имеют высокие температуры плавления. />100С/ и способны возгоняться без разложения, что используется для их очистки от посторонних примесей при выделении из биологического материала.