Хроматографические скрининговые методы

В настоящее время в качестве методов хроматографического скрининга наибольшее применение нашли:

1.ТСХ - тонкослойная хроматография (хроматография в тонких слоях сорбента).

2. ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография.

3. ГЖХ - газожидкостная хроматография.

4. ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография.

Хроматографию можно рассматривать как метод разделения веществ, в основе которого лежит разница в коэффициентах распределения этих веществ между подвижной и неподвижной фазами.

Тонкослойная хроматография (тсх)

В тонкослойной хроматографии роль неподвижной фазы выполняет фиксированный тонкий слой сорбента (0,1-0,5мм), содержащий определенное количество воды, нанесенный на хроматографическую пластинку из стекла, фольги, полимера. В качестве сорбентов чаще используют силикагель и окись алюминия. Для лучшего удерживания на пластинке в сорбент добавляют связующий компонент – гипс, крахмал и др. Роль подвижной фазы выполняет индивидуальный растворитель или их смесь, так называемая « хроматографическая система».

В процессе хроматографирования, по мере того как растворитель поднимается вверх по пластинке за счет капиллярных сил, происходит разделение смеси веществ согласно их коэффициентам распределения между подвижной и неподвижной фазами.

Детектирование (обнаружение) веществ на хроматограмме проводят, в основном, следующим образом:

• визуально, если вещество имеет собственную окраску,

• облучая пластинку УФ-светом - для веществ, обладающих флуоресценцией (свечением), или способных поглощать УФ-излучение (темные пятна на флуоресцирующем фоне),

- с помошью хромогенных реакций: бесцветные вещества переводят в окрашенные соединения, обрабатывая хроматографическую пластинку соответствующими реагентами.

Идентификацию веществ на хроматограммах проводят по коэффициенту R_f - («эр эф», скорость фракционирования).

R_f - это величина, численно равная отношению длины пробега анализируемого вещества к длине пробега растворителя.

R_f - является константой вещества в заданных хроматографических условиях при строгом их соблюдении. Однако, в практике соблюдение всех условий хроматографирования затруднено. Величина R_f - может колебаться в зависимости от целого ряда факторов:

- техники работы,

- качества и активности сорбента,

- толщины слоя,

- чистоты растворителей,

- степени насыщения камеры парами растворителей,

- температуры,

- присутствия балластных веществ и т.д.

Таким образом, чаще пользуются не абсолютным, а относительным значением R_f, которое обозначается R_st.

Относительный коэффициент R_st численно равен отношению абсолютной величины R_f вешества к величине R_f метчика.

R_st = R_f вещества/ R_f метчика

В качестве метчика используется вещество, принятое за стандарт. Относительное значение R_f более воспроизводимо, т.к. с изменением хроматографических условий синхронно меняются значения R_f как исследуемого вещества, так и вещества-стандарта, а их отношение остается более или менее постоянным. При совпадении величин R_f исследуемого вещества и вещества, используемого в качестве свидетеля, можно предположить их идентичность. В условиях скрининга R_f исследуемого вещества сравнивают с табличными данными, полученными в аналогичных условиях.

Метод ТСХ получил наиболее широкое распространение из перечисленных выше хроматографических методов благодаря своей доступности и простоте выполнения, и в то же время высокой эффективности, чувствительности, экспрессности, достаточной избирательности (специфичности).

Тонкослойная хроматография применяется в системе общего и частного скрининга и разработана для многих лекарственных средств, имеющих токсикологическое значение.

Хроматографический скрининг на основе ТСХ для большого ряда лекарственных веществ, имеющих токсикологическое значение, был разработан на кафедре токсикологической химии I ММА Гладких Г.М.

В качестве неподвижной фазы используется силикагель, подвижной фазы - 7 различных систем растворителей. В общем скрининге чаще используют следующие системы растворителей:

1. для веществ кислотного, нейтрального и слабоосновного характера, извлекаемых органическим растворителем из кислого водного раствора (первая подгруппа), - хлороформ-ацетон (9:1);

2. для веществ основного характера, извлекаемых органическим растворителем из щелочных растворов (вторая подгруппа), - диоксан-хлороформ-ацетон-25% раствор аммиака (47,5:45:5:2,5);

3. в последнее время при анализе наркотических и одурманивающих веществ, а также в экспресс-анализе острых интоксикаций используют универсальную систему растворителей толуол-ацетон-этанол-25% аммиак (45:45:7,5:2,5)

Для обнаружения (детектирования) веществ на хроматогаммах разработана схема последовательного их проявления:

Для веществ первой подгруппы:

УФ  ДФК + HgSO₄  FeCl₃  р-в Драгендорфа

(барбитураты) (производные (N-содержащие вещества пиразолона, слабоосновного характера)

салицил.к-та,

фенотиазины)

Для веществ второй подгруппы:

УФ  FeCl₃  HClO₄ + NaNO₂  р-в Драгендорфа

(пиразолоны, (фенотиазины, (N-содержащие вещества

фенотиазины) бензодиазепины, основного характера)

тиоксантены)

При обнаружении веществ в общих системах переходят к исследованию в частных. Примеры частных систем:

Для барбитуратов - хлороформ - н-бутанол - 25% раствор аммиака (70:40:5), детектор – ДФК (дифенилкарбазон) и HgSO_4.

Для алкалоидов опия - этилацетат-метанол-25% раствор аммиака (17:2:1), детектор - реактив Марки.

Разработанная методика проста, универсальна и может быть использована как в клинических лабораториях при экспресс-анализе интоксикаций, так и в БСМЭ при судебно-химических исследованиях.

Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

ВЭТСХ возникла в начале 70-х годов как новое направление в ТСХ. По сравнению с ТСХ имеет ряд преимуществ:

-более высокая эффективность (за один прием можно разделить до 40 веществ)

-высокая чувствительность и экспрессность.

Высокая эффективность данного метода достигается за счет применения высокодисперсного сорбента, а более высокая чувствительность и экспрессность - более тонкого слоя сорбента (10-15 нм).

В ВЭТСХ так же, как и в ТСХ, в качестве сорбентов применяют силикагель, окись алюминия, целлюлозу, метилцеллюлозу, полиамид, инактивированный силикагель и др.)

Ввиду более высокой чувствительности метода и малого количества наносимого образца стремятся, чтобы первичная зона адсорбции (размер пятна) на старте не превышала в диаметре 2мм. Методы хроматографирования в ВЭТСХ существенно не отличаются от ТСХ. Методы обнаружения так же идентичны, только должны быть более чувствительными. Количественное определение веществ на хроматограмме проводят методом сканирующей денситометрии, дающей точные результаты и не требующей элюирования вещества с пластинки.

ВЭТСХ, так же как и ТСХ, может сочетаться с другими физико-химическими методами анализа – спектральными, ГЖХ, ВЭЖХ, что повышает надежность определения.