Дипломы-2 / ВЗД-172 / Документы / Производство / ВЫСОКИЕ ТЕХНОЛОГИИ

Полученные данные (табл. 1) показывают, что уксусная кислота 2 в 3 раза превосходит по активности масляную кислоту 3 и в 6 раз монохлоруксусную кислоту 4.

Структуры полученных соединений доказаны данными ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Список литература

1. Hennis A.D., Polley J.D., Long G.S., Sen A., Huffman J. // Novel, efficient, palladium-based system for the polymerization of norbornene derivatives: scope and mechanism // Organometallics.- 2001.- 20.- P.2802-2812

РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИЗАТОРА ДЛЯ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ ПИЩЕВЫХ ЖИРОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ ЛИПАЗ

Ю. В. Самойлова1,2, К. Н. Сорокина2,3, М. А. Нуриддинов1,3, А. С. Розанов3 1Новосибирский государственный университет

2Институт катализа им. Г. К. Борескова СО РАН, г. Новосибирск 3Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

В последнее время активно развивающейся отраслью пищевой промышленности, как в России, так и в мире является производство маргаринов, спредов, кулинарных и других жиров специального назначения на основе ферментативной переэтерификации растительных масел и продуктов их гидрирования. Одним из важнейших преимуществ этого процесса, в отличие от других способов модификации жиров и масел (гидрогенизации, химическая переэтерификация), является то, что применение энзимной реакции не вызывает изомеризацию жирных кислот по ненасыщенным связям, что не приводит к образованию опасных для здоровья транс-изомеров жирных кислот. В многочисленнынных исследованиях показано, что содержание транс-жиров в организме повышает риск возникновения сердечнососудистых заболеваний, сахарного диабета и приводит к ряду других негативных последствий [1], что требует снижения их содержания в рационе. Также применение энзимной переэтерификации позволяет проводить менее энергозатратный, экологически

119

Секция 4. Химические и биотехнологии.

чистый биотехнологический процесс, и получать на основе различных масел продукты с заданными свойствами.

Правительства многих стран, в том числе и России, придерживаются политики уменьшения нормы содержания транс-жиров в продуктах питания. Комиссией Таможенного союза РФ 9 декабря 2011 года был принят технический регламент на масложировую продукцию 024/2011, вступающий в силу 1 июля 2013 года. Согласно этому регламенту в твердых и жидких маргаринах, в специализированных жирах, в эквивалентах масла какао, в улучшителях масла какао SOS-типа и в заменителях масла какао POP-типа содержание транс-изомеров жирных кислот с 1 января 2018 года не должно превышать 2% от содержания жира

впродукте. Сейчас этот показатель составляет 8%.

Вкачестве катализатора ферментативной переэтерификации выступают липазы, иммобилизованные на твердых носителях. Иммобилизация липаз на носителях позволяет добиться повышения термостабильности фермента, полного отделения от реакционной среды, возможности его многократного использования и увеличения длительности времени хранения. Существующие в настоящее время биокатализаторы обладают низкой термостабильностью из-за разрушения фермента под действием температуры. В связи с этим актуальной проблемой является увеличение стабильности биокатализаторов, используя ферменты, проявляющие высокую термостабильность.

Целью данной работы была разработка биокатализатора на основе иммобилизованных ферментов липаз р. Geobacillus, предназначенного для переэтерификации растительных масел и жиров.

Входе работы решались следующие задачи:

1)Выделение и исследование свойств рекомбинантных термостабильных липаз бактерий р. Geobacillus;

2)Исследование процессов адсорбционной и ковалентной иммобилизации термостабильных липаз на различных носителях;

3)Проводеление лабораторных испытаний разрабатываемого биокатализатора и коммерческого препарата Lipozyme TL IM в реакции ферментативной переэтерификации жиров;

4)Исследование состава продуктов переэтерификации жиров с использованием разрабатываемого биокатализатора и коммерческого препарата LipozymeTL IM.

Входе данной работы проводились исследования по поиску и выделению перспективных непатентованных ферментов, полученных из рекомбинантных штаммов бактерий р. Geobacillus [2]. Данный штамм является представителем термофильных бактерий, выделенных из термальных источников долины гейзеров п-ова Камчатка. Он отличается большей термостабильностью, чем активный компонент коммерческого катализатора для переэтерификации жиров Lypozyme TL IM (Новозаймс), следовательно, его иммобилизация позволит получить более стабильный биокатализатор. В качестве носителей для иммобилизации были выбраны ионообменные смолы и силикагель, так как по своим физико-химическим характеристикам они сходны с носителем, используемым для приготовления препарата Lypozyme TL IM.

Проводили наработку рекомбинантных штаммов E. coli xl-blue, несущих плазмиду pQS2, содержащую гены термостабильных липаз из Geobacillus stearothermophilus. Выделенные липазы подвергали последовательной очистке:

120

ВТСНТ – 2013

методом гидрофобной хроматографии на сорбенте Phenyl Sepharose и методом гельпроникающей хроматографии на сорбенте Sephadex G 75 [3, 4]. Полученные таким образом высокоочищенные ферменты исследовали на термостабильность, измеряя каталитическую активность ферментов спектрофотометрическим методом в диапазоне температур от 40 до 100 ºС (рисунок 1) [5]. Также проводили измерение количества белка в препаратах методом Бредфорда и оценку его молекулярного веса методом SDS-PAGE электрофореза в 12 % SDS (рисунок 2).

45 кДа

31 кДа

Приготовление опытных партий катализаторов осуществляли двумя различными методами иммобилизации ферментов: без образования ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации). Методом физической иммобилизации проводили адсорбцию фермента на анионообменной смоле Lewatit MP-64 c функциональной третичной и четвертичной аминогруппами. Химическую иммобилизацию фермента проводили на аминированном силикагеле, обработанном глутаровым альдегидом, с функциональной карбокси-группой (рисунок 3) [6]. Данный метод был модифицирован, что позволило добиться более прочного связывания носителя с ферментом, чем при физической адсорбции, что обусловлено наличием между ними водородных связей.

Испытания биокатализатора, полученного глутаральдегидным способом, и коммерческого препарата Lypozyme TL IM в реакции переэтерификации жиров проводили на установке проточного типа с неподвижным слоем катализатора. В качестве исходного сырья для процесса переэтерификации использовали смесь рафинированного соевого масла и саломаса, полученного полным гидрированием соевого масла.

Во время контакта со смесью жиров иммобилизированная липаза вступает в реакцию ферментативной переэтерификации, характеризующуюся изменением триацилглиреридного состава смеси. В процессе реакции осуществлялся мониторинг изменений физических свойств смеси масел на основе измерения содержания твердых триацилглицеридов (ТТГ) в исходной смеси жиров и

121

Секция 4. Химические и биотехнологии.

продуктах реакции в температурном диапазоне 10-35°С с использованием ЯМРанализатора (рисунок 4). Как видно из представленных данных, значение ТТГ при увеличении времени контакта в реакторе равномерно снижается, что говорит о протекании реакции переэтерификации в смеси, а также изменении физических свойств продукта по отношению к исходной смеси.

Рис. 3. Иммобилизация фермента на обработанном глутаровым альдегидом аминированном силикагеле

Также методом высокоэффективной жидкостной хроматомассспектрометрии параллельно проводилось измерение содержания триацилглицерида SSS, являющегося основным компонентом саломаса, и показано образование триацилглицеридов SLS и SOS – продуктов переэтерификации. Предполагается, что в тот момент, когда дальнейших изменений физических свойств не наблюдается, реакция переэтерификации достигла точки равновесия, то есть переэтерификация исходной смеси прошла полностью.

Рис. 4. Зависимость кривых содержания ТТГ от температуры при разных значениях времени контакта

Таким образом, в результате работы было проведено выделение и исследование свойств термостабильных рекомбинантных липаз экстремофильных бактерий р. Geobacillus, обладающих высокой термостабильностью при температурах 50-55 ºС. Проведено выделение ферментов с использованием гидрофобной и гель-проникающей хроматографии, оценено количество очищенного белка и его молекулярный вес (42 кДа). Было проведено сравнение катализаторов, полученных методами физической и химической иммобилизации. Оптимизирован

122

ВТСНТ – 2013

процесс ковалентной иммобилизации ферментов на аминированном силикагеле, обработанном глутаровым альдегидом. Активность полученного биокатализатора составила 1300 ЕА/г. Были подобраны условия проведения реакции переэтерификации на проточном реакторе с использованием разрабатываемого катализатора.

Список литературы

1.Kirk O., Borchert T., Fuglsang C. Industrial enzyme applications // Curr. Opin. Biotechnol. – 2002. - N 13(4). - Р. 345-51.

2.Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., Liu, R. and Wang, L. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deepsubsurface oil reservoir // Proceedings of National Academy of Science. – 2007. - N 104. – Р. 5602-5607.

3.Imamura S., Kitaura S. Purification and characterization of a monoacylglycerol lipase from the moderately thermophilic Bacillussp. H-257 // J. Biochem. – 2000. - N 127. – Р. 419-425.

4.Hong M.C., Chang M.C. Purification and characterization of an alkaline lipase from a newly isolated Acinetobacter radioresistensCMC-1 // Biotechnol. Lett. – 1998. - N 20. - Р. 1027-1029.

5.Jaeger K.E., Reetz M.T. Microbial lipases form versatile tools for biotechnology // Trends Biotechnol. – 1998. – N 16. – P. 396–403.

6.Koopal L.K., Yang Y., Minnaard A.J. Chemical immobilization of humic acid on silica // Coll.and Surf. - 1998. - N 141. - P. 385-395.

СОРБЦИОННОЕ ИЗВЛЕЧЕНИЕ РАДИОНУКЛИДОВ ИЗ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ НАНОТРУБКАМИ

А. С. Сатыбекова, студент гр. 4ГМ21 Томский политехнический университет, 634050, г.Томск, пр.Ленина,30,

тел.8-923-403-69-90

E-mail: anara77790@tpu.ru

Производство обогащенного урана сопровождается рядом химических процессов, в результате которых образуются и накапливаются жидкие и низкоактивные радиоактивные отходы [1]. Радионуклиды, поступающие в окружающую среду, переносятся воздушными и водными потоками на большие расстояния от источника поступления, оседая на новых местах, создают зоны радиоактивного загрязнения.

Особенность радиоактивного загрязнения заключается в том, что его невозможно ликвидировать химическим путём. В этой связи техногенные радионуклиды, поступившие или поступающие в поверхностные водоёмы, должны быть переведены в твердую фазу и в виде радиоактивных отходов изолированы.

Среди методов, успешно применяемых для извлечения радионуклидов из водных сред, можно назвать сорбцию органическими и неорганическими материалами.

123

Секция 4. Химические и биотехнологии.

Объединенная группа исследователей [2] провела поиск потенциальных кандидатов для «умных» наноадсорбентов из числа ионообменных материалов слоистой структуры (например, нановолокно). Ученые в своем исследовании использовали наноадсорбент волокнистой структуры титанат натрия () [3]. Титанат натрия помещали в раствор хлорида стронция и хлорида бария . Методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии было определен состав образцов наноматериала после адсорбции.

Новизна проекта и его результатов заключалась в том, что поглощение двухвалентных токсичных радиоактивных катионов нановолокнами в конечном счете приводит к разрушению структуры и деформации нановолокна, которая фиксирует радиоактивные катионы в решетке. Эти, уловленные, катионы оказываются, перманентно, заключены в структуре адсорбента, что гарантирует их безопасное удаление.

Более того, нановолокна твердотельных титанатов способны к избирательному поглощению радиоактивных катионов в присутствии множества других конкурирующих ионов. Известно, что титанаты устойчивы к радиации, химическим веществам, термическому воздействию и механическим нагрузкам, что делает их идеальным носителем радиоактивных ионов. Еще одним преимуществом использования нановолокон титаната является доступность и обилие сырья для его синтеза ( и NaOH), а также легкость отделения титаната от жидкой среды простым фильтрованием, осаждением или центрифугированием благодаря его волокнистой структуре. К тому же адсорбция радиоактивных ионов нановолокнистыми структурами происходит очень быстро. Из всего этого следует, что нановолокна титаната являются эффективными адсорбентами радиоактивных ионов из загрязненной водной среды.

Хотя титанатные нанотрубки и нановолокна в основном были интенсивно изучены в качестве сорбентов ионов тяжелых металлов (Sr, Ba, Cd, Cu) [3, 4], существует несколько работ, сфокусированных на их адсорбционных свойствах по отношению к радиоактивным ионам. Так, в работе [5] было проведено значительное фундаментальное исследование по удалению радиоактивных ионов из сточных вод с использованием титанатных нанотрубок, полученных реакцией между нанопорошком металлического титана Ti и гидроксидом натрия NaOH с использованием простого и эффективного гидротермального метода. В качестве источника урана был использован гексагидрат нитрата уранила ().

Результаты электронной микроскопии (TEM) нанотрубок показывают, что после адсорбции сорбент претерпевает значительные структурные деформации - нанотрубки представляют собой развернутый лист после сорбции ионов урана.

В результате деформации нанотрубок титаната ионы урана оказываются, перманентно, заключены в слоистой структуре. Таким образом, нанотрубки могут быть применены в качестве матриц для иммобилизации радионуклидов.

Было выявлено, что процесс адсорбции радиоактивных ионов идёт быстро. Также экспериментально доказано, что количество адсорбированных ионов урана в первые 24 часа составляет около 99% от конечной равновесной емкости. Таким образом, можно сделать вывод о том, что титанатные нанотрубки являются одними из наиболее эффективных сорбентов для поглощения ионов урана из загрязненных природных вод.

124

ВТСНТ – 2013

Исследования в области разработки сорбционных методов извлечения радионуклидов из водных сред направлены на создание сорбционных материалов с улучшенными селективными и кинетическими характеристиками. Используются различные подходы к получению сорбентов: синтез принципиально новых типов сорбционных материалов, модифицирование существующих природных и синтетических неорганических и органических ионообменников путем введения в

различные матрицы комплексообразующих групп, получение селективных по отношению к радионуклидам тонкослойных, композиционных и гибридных сорбентов на основе доступных и дешевых природных и технологических продуктов [7]. Между тем возможности потенциального применения гибридных сорбентов на основе микробиологических объектов и наноматериалов в ликвидации радиоактивных загрязнений природных вод расширяются. Полученные результаты по синтезу и исследованию новых сорбционных материалов показывают перспективность их использования для решения актуальных экологических и технологических задач [7].

Список литературы

1.Филиппов Р. А. Способ очистки сбросных растворов, образующихся при извлечении остаточного урана на разделительных производствах// Экология и промышленность России. -2012.-№4.- С.8-9

2.D.J. Yang, Z.F. Zheng, H.Y. Zhu, H.W. Liu, X.P. Gao // Advanced Material, 2008, v. 20, p. 2777-2781

3.H.Y. Zhu, X.P. Gao, Y. Lan, D.Y. Song Y.X. Xi, J.C. Zhao // Journal American Society, 2004, v. 126, p. 8380

4.D.J.Yang, S.Sarina, H.Y.Zhu, H.W.Liu, Z.F.Zheng, M.X.Xie, S.V.Smith, and S. Komarneni, Angew. Chem. Int. Ed.,(2011),vol.50,p.10594.

5.Liu, C.Lee, H.Chen, C.Wang and L.Juang, Chem. Engin. J.,(2009),vol.147, p.188.

6.M.Xu, G.Wei, S.Li, X.Niu, H.Chen, H.Zhang, M.Chubik, A.Gromov, W.Han// Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2012, v. 12 ( 8), p. 6374-6379

7.Мясоедова Г. В., Никашина В. А. Сорбционные материалы для извлечения радионуклидов из водных сред// Рос. Хим. Ж. – 2006.- т. L. - №5.- C. 55-63

НАНОЧАСТИЦЫ МЕТАЛЛОВ, ПОКРЫТЫЕ УГЛЕРОДОМ КАК СУБСТРАТ ДЛЯ КОВАЛЕНТНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОМОЛЕКУЛ

Н.С. Солдатова Национальный исследовательский Томский политехнический университет

634050, г. Томск, пр. Ленина, 30, тел. (3822)563-861

E-mail: soldatova_natalia@inbox.ru

В настоящие время активно ведутся работы по получению органонеорганических материалов, на поверхности которых привиты биологически активные молекулы (лекарственные вещества, антитела, антигены, лигандные группировки) [1,2]. Данные материалы находят применение в таких областях как биотехнология, аналитическая химия, катализ и многих других. Особенно интересным направлением является использование данных материалов для медицинской диагностики и целевой доставки лекарственных веществ [3,4].

125

Секция 4. Химические и биотехнологии.

Магнитоуправляемые наночастицы предлагается использовать как агенты для магнитной сепарации катализаторов в органическом синтезе [5,6] или очистки воды от нежелательных примесей.

Для медицинской диагностики и терапии принципиальными являются низкая токсичность наноматериалов в сочетании с функциональной активностью. Недавно открытые наночастицы металлов, покрытые углеродом, сочетают в себе как низкую токсичность, так и способность к легкой поверхностной функционализации (5,7) с использованием солей диазония.

Для придания максимальной функциональной активности необходима разработка методов иммобилизации биомолекул на поверхности наночастиц металлов, покрытых углеродом. Поэтому целью данной работы является получение иммобилизованных биомолекул на поверхности наночастиц, полученных методом электроискрового диспергирования.

На первом этапе исследования нами были получены ковалентнофункционализированные наночастицы железа, покрытые углеродом, содержащие на поверхности карбокси-группы. Карбокси-группы легко и количественно могут быть превращены в соответствующие амиды с использованием хорошо изученных методов, широко использующихся в твердофазном синтезе. Процесс модификации проводился по методу [4] с использованием 4-карбоксибензолдиазоний тозилата (схема 1).

Схема 1. Модификация поверхности наночастиц солью диазония

В качестве модельного соединения для изучения процессов иммобилизации был выбран тирозин – представитель ряда аминокислот. Процесс иммобилизации проводился по схеме (схема 2):

Схема 2.Иммобилизация тирозина на поверхности наночастиц

126

ВТСНТ – 2013

На первой стадии поверхностные карбоксильные группы превращались в соответствующий N-гидроксисукцинимидный эфир с использованием EDC, после чего полученный материал тщательно промывался буферным раствором от непрореагировавших EDC и NHS. После чего к наноматериалу добавлялся раствор тирозина в 10% NaOH, реакционная смесь выдерживалась в течение 20 минут при комнатной температуре и модифицированные наночастицы отделялись с использованием постоянного магнита (0,2 Тл). Концентрация тирозина в промывных водах определялась по поглощению окрашенного комплекса с нингидрином при 570 нм.

Полученные материалы анализировались методами ИК-спектроскопии и термогравиметрии. В ИК-спектре полученных материалов обнаруживаются полосы колебаний связей, характерных для тирозина и полосы колебаний амидных связей, свидетельствующих об образовании ковалентной связи между молекулой тирозина и карбоксильными группами на поверхности наночастиц.

Проведенное исследование показывает, что наночастицы металлов, покрытые углеродом, могут быть использованы как субстрат для ковалентной иммобилизации биомолекул.

Список литературы

1.Le Floch F., Bidan G., Pilan L. et. al. Carbon substrate functionalization with diazonium salts toward sensor applications // Mol. Cryst. Liq. Cryst. – 2008. – 486.

– 271-281;

2.Vaijayanthimala V., Chang H.-C. Functionalized fluorescent nanodiamonds for biomedical applications // Nanomedicine. – 2009. – 4. – 1. – 47-55;

3.Otsuka H., Nagasaki Y., Kataoka K. PEGylated nanoparticles for biological and pharmaceutical applications // Adv. Drug. Del. Rev. – 2003. – 55. – 403-419;

4.Sanvicens N., Pilar Marco M. Multifunctional nanoparticles – properties and prospects for their use in human medicine // Trends in Biotech. – 2008. – 26. – 8. – 425-433;

5.Grass R.N., Athanassiou E.K., Stark W.J. Covalently functionalized cobalt nanoparticles as a platform for magnetic separations in organic synthesis // Angew. Chem. Int. Ed. – 2007. – 46. – 4909-4912;

6.Grass R.N., Stark W.J. Carbon coated magnetic nanoparticles and their use in separation processes // Patent WO 2008/055371 A2. – 15 may 2008;

7.Postnikov P.S, Trusova M.E., Fedushchak T.A., Uimin M.A., Ermakov A.E., Filimonov .VD. Aryldiazonium tosylates as new efficient agents for covalent grafting of aromatic groups on carbon coatings of metal nanoparticles// Nanotechnologies in Russia – 2010. – 5 – 446-449.

127

Секция 4. Химические и биотехнологии.

ТЕХНОЛОГИЧНЫЙ СИНТЕЗ ФОСФАТА ОСЕЛЬТАМИВИРА

Е.Г. Сонина, инженер, А.И. Калашников, к.х.н., н.с. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт

проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук,659322, г. Бийск Алтайского края, ул Социалистическая 1,

тел.(3854)- 30-10-58

E-mail: sonina84@yandex.ru

Фосфат осельтамивира 1 (Тамифлю) – универсальное лекарство против вируса гриппа. Основным природным источником его получения является природная (-)-шикимовая кислота, использование которой позволяет сравнительно легко получать нужный стереоизомер [1]. Наиболее короткий и удобный путь получения фосфата осельтамивира приведен на схеме [2]:

R = Et (a), Me (b), iPr (c)

На первой стадии производится этерификация (-)-шикимовой кислоты (2) этанолом. Наилучшие результаты обеспечивает использование в качестве кислотного катализатора катионита КУ-2-8, при непрерывном удалении выделяющейся в ходе реакции воды с помощью цеолита NaA. При этом конверсия шикимовой кислоты достигает 99,5 %.

На следующей стадии (3R,4S,5R)-3,4,5-о-Триметилсульфонилэтилшикимат (4) образуется достаточно гладко при обработке этлшикимата 3 MsCl в присутствии триэтиламина. Содержание примесей в полученном продукте не превышает 5 %. Не смотря на это продукт требует дополнительной очистки, так как использование неочищенного продукта на следующих стадиях синтеза приводит к накоплению примесей и, как следствие, снижению выхода.

Этил (3S,4R,5R)-3-азидо-4,5-диметилсульфонилокса-циклогекс-1-ен-1- карбоксилат (5) образуется при обработке 4 азидом натрия. При этом происходит региоселективное замещение одной из метилсульфонильных групп (в положении 3) и обращение конфигурации углерода в положении 3 с R на S. Для успешного

128