Методические указания:

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда".

1.Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды "пестрого ряда".

2.Посевы инкубируют при 37° С в течение 18—24 ч или больше.

3.В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды;

4.При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке.

5.Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика.

При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом».

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью среды Клиглера

1. Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей на среду Клиглера

2. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч.

3. В том случае, если бактерии ферментируют лактозу до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в области скошенной части.

4. В том случае, если бактерии ферментируют глюкозу до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в области «столбика».

5. В том случае, если бактерии выделяют сероводород, наблюдается изменение цвета среды с красного на черный в области «столбика».

6. При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляются пузырьки газа в толще среды.

При отсутствии ферментации цвет среды не меняется.

Контрольные вопросы:

1.Для чего проводится идентификация микроорганизмов?

2. Какие методы идентификации наиболее часто применяются в современных бактериологических лабораториях?

3. Для чего применяется «пестрый ряд» и каков его состав?

4. Что такое протеолитические свойства? Каким образом можно их определить?

5. Что такое СИБы? Для идентификации каких бактерий их применяют?

Список литературы:

Обязательная:

1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.

3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология , вирусология , иммунология. СпецЛит, 2000 г

4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.

2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 6 Физиология микроорганизмов. Дыхание микроорганизмов. Анаэробы. Методы культивирования. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Дезинфекция. Стерилизация.

Цель: Изучить принципы создания сред для анаэробов и методы их культивирования, основные методы стерилизации и дезинфекции и оборудование, применяемое для этого.

Знать: Особенности дыхания микроорганизмов, основные методы выделения чистых культур анаэробов, состав питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, способы контроля дезинфекции и стерилизации.

Уметь: Описывать культуральные свойства анаэробных бактерий и уметь выбрать способ дезинфекции и стерилизации в зависимости от свойств объекта.

Обоснование темы: Анаэробы являются возбудителями многих заболеваний, для их диагностики требуются специфические методы культивирования.

Вопросы для самоподготовки:

1.Дыхательные цепи микроорганизмов.

2.Классификация микроорганизмов по типу дыхания.

3.Особенности питательных сред для анаэробов.

4. Создание условий для культивирования анаэробов.

5. Методы выделения чистой культуры анаэробов.

6. Стерилизация и дезинфекция.

7. Контроль качества дезинфекции и стерилизации.

ПЛАН

Программа:

1. Изучение питательных сред для анаэробов: среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера, молоко по Тукаеву.

2. Описание культуральных свойств анаэробов.

3. Изучение способов создания анаэробных условий.

4. Методы стерилизации; аппаратура, используемая для стерилизации.

5. Методы дезинфекции.

6. Методы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции.

Демонстрация:

1. Питательные среды – среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера.

2.Варианты роста анаэробов на этих питательных средах.

3. Эксикатор, анаэростат.

4. Аппаратура, применяемая для стерилизации.

Задание студентам:

1. Зарисовать и записать состав и назначение питательных сред: среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, молоко по Тукаеву, агар Цейсслера.

2. Описать особенности роста анаэробов на питательных средах.

3. Учесть результаты опытов, поставленных с целью контроля стерилизации. Сделать заключение. Заполнить таблицу: Методы контроля режима стерилизации.

4. Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФ-излучения на стафилококки.

5. Заполнить таблицу: Основные методы дезинфекции и контроля качества дезинфекции.

6. Оценить результаты посева материала на скошенный МПА.

Информационный материал.

Питательные среды для выращивания анаэробов:

Среда Вильсон-Блер (железосульфитный агар) готовиться из питательного агара, к которому добавляется глюкоза, сульфит натрия, хлорид железа (2). Анаэробные клостридии на этой среде образуют колонии черного цвета за счет восстановления сульфита натрия в сульфид, который, соединяясь с хлоридом железа, дает черный осадок.

Среда Китта-Тароцци. Состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла.

Тиогликолевый бульон с гемином (элективная среда для культивирования неспорообразующих анаэробов). Состоит из гемина, гидролизата казеина, глюкозы, цистеина, сульфата натрия, хлорида натрия, тиогликолата натрия.

Сахарно-кровяной агар Цейсслера. Состоит из питательного агара, 1-2 % глюкозы, дефибринированной крови.

Среда Вейнберга. Состоит из питательного агара, печени, фосфата натрия, 0,5 % глюкозы, хлористоводородной кислоты.

Стерилизация (обеспложивания, «sterilis»—бесплодный)– полное уничтожение объекта от всех микроорганизмов, находящихся как в вегетативных, так и споровых формах. Для стерилизации применяют в основном физические методы: стерилизация в сушильно-стерилизационном шкафу, стерилизация текучим паром, тиндализация, автоклавирование, прокаливание, воздействие ионизирующих излучений, кипячение. Методы стерилизации

1. Физические методы. Существуют различные способы стерилизации при помощи высокой температуры

1. Прокаливание на огне - фламбирование (спиртовка) — применяется для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл, предметных стекол, пинцетов.

2. Кипячение применяется редко. Кипячением в воде в течение 10-40 минут можно стерилизовать многоразовые шприцы, иглы.

3. Стерилизация сухим жаром производится в печах Пастера. Сегодня для этой цели применяются сухожаровые шка­фы различных марок. Простейшая печь Пастера состоит из металлической емкости с двойными стенками, оборудованной термометром для контроля температуры и нагревательным элементом.

Приготовленный соответствующим образом материал ставят в печь и стерилизуют в течение 45 минут при температуре 165—170°. Пробирки, колбы, флаконы закрывают ватными пробками.

4. Стерилизация паром проводится при более низкой температуре чем стерилизация сухим жаром, и производится при температуре в 100—120°.

Различают:

1) стерилизация паром под давлением,

2) стерилизация текучим паром.

Стерилизация паром под давлением — основана на том, что образующийся пар не выходит наружу, а скапливается в замкнутом пространстве и повышает давление. Соответственно давлению повышается и температура кипения воды; при повышении давления на 1 атм. температура кипения будет равна 120°, при повышении давления на 2 атм.— 134,18° и т. д. При такой температуре микро­организмы и их споры погибают очень быстро (при 120° в течение 15—20 минут).

Этим способом стерилизации пользуются для обеспложивания питательных сред, лабораторной посуды, металлических и стеклянных инструментов, для обеззараживания инфекционного материала .

Стерилизация паром под давлением производится в автоклавах. На сегодняшний день это самый распространенный способ стерилизации в бактериологической практике

Автоклав представляет, собой металлическую цилиндрическую емкость с толстыми двойными стенками и с герметически закрывающейся массивной крышкой. Автоклав оборудован манометром и термометром для контроля давления и температуры. Под дном автоклава находятся нагревательные элементы. Стерилизуемые предметы помещают внутрь емкости и герметично закрывают крышку, начинается повышение давления и температуры.

Стерилизация текучим паром производится в аппарате Коха (рис. 38), представляющем собой высокий металлический цилиндр, с двойным дном и неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно аппарата наливают воду, подогреваемую снизу до кипения. Образующийся пар выделяется через края неплотно закрытой крышки. Стерилиза­цию производят в течение 30—40 минут с момента выделения пара.

Стерилизацию текучим паром можно производить также и в автоклаве; в таком случае крышка автоклава остается незавинченной, а выпускной кран открытым. Текучим паром стерилизуют предметы, портящиеся от действия высокой температуры (питательные среды).

Однократная обработка текучим паром не обеспечивает полной стерилизации, так как при температуре в 100° гибнут вегетативные формы, но не споры бактерий. Полное обеспложивание при помощи текучего пара достигается при повторной (дробной) стерилизации.

Дробная стерилизация. Дробной стерилизации подвергаются материалы, не переносящие температуры выше 100° (жела­тина, молоко, питательные среды с углеводами). При температуре в 100°погибают вегетативные фор­мы бактерий, затем дают оставшимся спорам прорасти в вегетативные формы и через сутки снова стерилизуют материал при 100°. Оставшимся спорам снова дают прорасти и через сутки снова стерилизуют материал при 100°, добиваясь таким образом 100% стерилизации

Тиндализация представляет собой дробную стерилизацию при низкой температуре, предложенную Тиндалем для объектов, не переносящих температуры в 100°. Их подвергают нагреванию в течение 5—6 дней подряд при более низкой температуре ( 56—60°) по 1 часу ежедневно. Тиндализация производится или на водяной бане, или в специальных приборах с терморегуляторами.

Пастеризация. Метод предложен Пастером для частичной стерилизации жидкостей, теряющих свои качества под действием высокой температуры), используется при температурной обработке продуктов питания(соки, молоко, вино ). Способ основан на том, что при нагревании жидкости до 50—60° в течение 15—30 минут или до 70—80° в течение 5—10 минут погибает большинство бесспоровых микробов, а споры остаются жизнеспособными. Поэтому необходимым условием является упаковка и охлаждение пастеризованного продукта.

В бактериологической практике пастеризация при 90° применяется для разделения споровых и бесспоровых видов бактерий.

5. Обработка материалов рентгеновскими, ультрафиолетовыми, γ-лучами

Радиационный метод стерилизации используется для стерилизации изделий медицинского назначения одноразового применения (одноразовые чашки Петри)

Стерилизация ультрафиолетовым облучением используется для стерилизации воздуха помещений медицинского назначения, сложных изделий медицинского назначения (искусственный клапан сердца и т.д.)

2. Механические методы стерилизации.

Стерилизация фильтрованием.

Применяется в тех случаях, когда материал не может быть подвергнут нагреванию (сыворотки, белковые лекарственные вещества и т. д.).

Для этой цели применяются фильтры тонкой очистки из мелкопористых веществ. Они готовятся в виде цилиндрических свечей (фильтр Шамберлана, Берке-Фельда) или асбестовых пластинок (фильтр Зeйтца).

Фильтрование производится под повышенным давле­нием, вследствие чего жидкость нагнетается через поры фильтра в приемник, или же создается разрежение в приемнике и тогда жидкость всасывается в него через фильтр. Поэтому к фильтрующему прибору присоединяется или нагнетающий, или разрежающий насос.

Наиболее простым способом является фильтрование с по­мощью водоструйного насоса: в приемнике создается отрица­тельное давление и жидкость всасывается через фильтр. Стерильность профильтрованной жидкости проверяется путем ее посева на питательную среду - посев остается стерильным.

3. Химические методы. Методы основаны на обработке оборудования химическими веществами, обладающими бактерицидными свойствами. Применяются при стерилизации приборов и материалов, чувствительным к высоким температурам.

Дезинфекция – мероприятия, направленные на уничтожение или снижение численности микроорганизмов. Для дезинфекции применяют физические и химические методы.

Механические методы – влажная уборка.

Физические методы: кипячение, сжигание трупов.

Химические методы: методы с использованием веществ, обладающих антисептическими свойствами (дезинфектантов)

Классификация дезинфектантов

1. галогенсодержащие дезинфектанты (имеют в своем составе галогены) — препараты йода (спиртовой раствор йода, раствор Люголя, йодоформ, йодинол, йодопирин), хлора (хлорамины, хлориты);

2. перекисные соединения - перекись водорода, пергидроль (30% водный раствор перекиси водорода) дезоксон-1 и др.

3. кислоты и их соли - борная, салициловая, тетраборат натрия, калия перманганат, щелочи - аммиак и его соли, бура;

4. спирты - 70°—80° этанол и др.;

5. альдегиды - формальдегид, гексаметилен-тетрамин, бетапропиолактон;

6. детергенты - декамин, хлоргексидин, этоний и др.

7. поверхностно-активные вещества, относящиеся к четвертичным аммониевым соединениям и амфолитам (ниртан, амфолан и др.)

8. производные 8-оксихинолина - хинозол, интестопан, нитроксолин, 4-хинолона - оксолиновая кислота, хиноксалина - хиноксилин, диоксидин;

9. производные нитрофурана - фурацилин, фурагин, фуразолидон;

10. производные фенола - трикрезол, фенилрезорцин, фенилсалицилат;

11. дегти - деготь березовый, ихтиол и др.;

12. красители - бриллиантовый зеленый, метиленовый синий, этакридина лактат;

13. соединения тяжелых металлов - дихлорид ртути, нитрат серебра, колларгол, протаргол, сульфат цинка.

14. газовая смесь из оксида этилена с метилбромидом