Информационный материал.

Основные среды:

Пептонный бульон. Выпускается в сухом виде, состоит из триптического гидролизата кильки хлорида натрия.

Питательный агар. Состав: ферментативный гидролизат кормовых дрожжей, агар, хлорид натрия.

Элективные питательные среды.

Желточно-солевой агар. Содержит 8-10% хлорида натрия, который не препятствует росту стафилококков и питательную основу с лецитином, при расщеплении которого вокруг колоний образуется перламутровый венчик преципитата.

Дифферинциально-диагностические среды.

Среда Эндо - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к дифференциально-диагностическим. Применяется для посева и выделения энтеробактерий. До посева имеет розоватый цвет.

Состав: МПА - питательная основа; лактоза - дифференциальный фактор; фуксин, нейтрализованный гипосульфитом - индикатор на РН.

Принцип работы среды - если выросшие микроорганизмы расщепляют лактозу, среда закисляется, РН меняется в кислую сторону, колонии будут окрашенными в тёмнокрасный цвет иногда с металлическим блеском. Так выглядят на этой среде колонии кишечной палочки. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда Плоскирева - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения патогенных энтеробактерий. До посева имеет цвет обычного МПА.

Состав: МПА - питательная основа; соли желчных кислот - элективный фактор; лактоза - дифференциальный фактор; нейтральный красный - индикатор на РН.

Принцип работы среды - соли желчных кислот подавляют рост непатогенных энтеробактерий (они могут расти на этой среде, но не через 24 часа, а позже - через 48); если микробы расщепляют лактозу, колонии будут окрашены в красный цвет. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда ЖСА (желточно-солевой агар) - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения стафилококков.

Состав: МПА - питательная основа; 10% NaCl - элективный фактор; лецитин куриного желтка – дифференциальный фактор.

Принцип работы среды - 10% NaCl подавляют рост других микробов, поэтому на ней вырастают преимущественно стафилококки; если стафилококки продуцируют фермент лецитовителлазу, расщепляющий лецитин, вокруг таких колоний появляется зона помутнения. Чаще всего так выглядят на ЖСА колонии Staphylococcus aureus.

Требования к питательным средам:

1. Среды должны быть питательными, т.е. содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества: источники азота, углерода, водорода и кислорода, минеральные соли, факторы роста для ауксотрофных микроорганизмов.

2. Среды должны быть изотоничными, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же как и внутри клетки, для чего в среду добавляют 0,5 % NaCl.

3. Среды должны быть стерильными для обеспечения возможности выделения чистой культуры

4. Среды должны содержать достаточное количество доступной воды т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии.

5. Среды должны обладать определенным ОВП, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих.

6. Среды должны быть прозрачными – удобнее следить за ростом культур.

7. Среды должны быть по возможности унифицированными по содержанию основных компонентов: содержание аминного азота, общего азота, содержание хлоридов, пептона.

Культуральные свойства микроорганизмов – особенности роста микроорганизмов на плотной питательной среде.

Бактериологический метод – основной метод диагностики инфекционных заболеваний. Включает в себя посев исследуемого материала на питательные среды, выделении чистой культуры и ее идентификацию( посев на плотные питательные среды, на жидкие питательные среды, определение морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, свойств, чувствительности к антибиотикам, количества микроорганизмов в исследуемом материале – определение вида и штамма микроорганизма.)

Выделение чистой культуры основа бактериологической работы, т. к. в процессе деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микроорганизмов, а идентификация вида возможна тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.

Для получения чистой культуры необходимо отделить клетки разных видов друг от друга. По способу их отделения различают две основных группы методов выделения чистых культур:

1. Методы, основанные на механическом разделении.

2. Методы, основанные на различиях в биологических свойствах.

Чаще всего используют механические способы разъединения бактериальных клеток - специальные методы посева.

Техника посева материала на плотную питательную среду.

Получение изолированных колоний. Образование изолированных колоний достигается путем механического распределения микробов при посеве. Существует несколько способов посева материала.

Посев по методу Дригальского производится шпателем в чашку Петри на плотную питательную среду. Предварительно в центр среды петлей вносят каплю исследуемой культуры, а затем растирают по всей поверхности с помощью стерильного шпателя.

Посев истощающим штрихом производят петлей, предварительно разделив чашку Пери на 4 равных квадрата. Посев начинают с 1 квадрата параллельными штрихами и заканчивают в 4 квадрате.

Получение сливного роста можно использовать для накопления полученной культуры . В пробирку со скошенным агаром вносят петлю с материалом и производят посев зигзагом, двигаясь снизу вверх.

Ко второй группе методов получения чистых культур микроорганизмов относятся:

а) фильтрация. Исследуемый материал пропускают через специальные фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют микроорганизмы по величине (например, для очистки вирусов от бактерий)

Биологические методы выделения основаны на различиях в биологических свойствах микроорганизмов.

а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, при этом подвижные формы микроорганизмов при размножении «выползают» на поверхность агара из конденсационной воды (Proteus vulgaris).Отсевая верхний край культуры в воду свежескошенного агара и повторяя эту манипуляцию несколько раз, можно получить чистую культуру.

б) метод прогревания – прогревают материал до 80⁰С на водяной бане 10-15 мин., при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при посеве на питательную среду прорастают ( метод позволяет отделить споровые культуры от неспоровых)

в) метод охлаждения – выращивание микроорганизмов при низких температурах. Применяют для выделения чистых культур психрофильных бактерий (микроорганизмы рода Yersinia выращивают при температуре 5⁰ С)

г) бактериостатический метод при посеве в исходный материал добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на других (пенициллин задерживает рост Гр+ микроорганизмов, не влияя на ГР-, 5% Н₂SO₄ убивает большинство микроорганизмов, исключая кислотоустойчивых (возбудитель туберкулеза)

д) метод обогащения посев на элективные среды

е) заражение лабораторных животных.

Методические указания:

Схема описания культуральных свойств микроорганизмов:

1.Форма колонии

2.Размер колонии

3.Цвет

4.Характер края

5.Характер поверхности

6. Консистенция

Посев по методу Дригальского.

1.Подготовить 3 чашки Петри со стерильной питательной средой.

2. В центр среды петлей вносят 1 каплю исследуемой культуры.

3. Равномерно растирают каплю шпателем по поверхности питательной среды в чашке Петри.

4. Не обжигая шпателя, переносят материал последовательно во вторуюи третью чашки Петри.

На третьей чашке Петри после инкубации должны вырасти изолированные колонии микроорганизмов.

Посев истощающим штрихом.

1.Подготовить чашку Петри со стерильной питательной средой.

2. Разделить чашку Пери на 4 равных квадрата.

3. Посев производят петлей, начинают с 1 квадрата параллельными штрихами и заканчивают в 4 квадрате.

Таблица. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

Метод выделения чистой культуры	Описание метода	Область применения

Схема бактериологического метода лабораторной диагностики

Исследуемый материал

I этап (нативный материал): Микроскопия.

Посев на среды обогащения или на плотные питательные среды

II этап (изолированные колонии): Изучение культуральных, тинкториальных и морфологических свойств. Посев на скошенный питательный агар для выделение чистой культуры

III этап (чистая культура): Идентификация выделенной культуры.

Заключение о выделенной культуре

Контрольные вопросы:

1.Для чего предназначены питательные среды и каковы основные требования к ним?

2. Какие элективные среды Вам известны? Назовите их состав.

3. Какие методы применяются для выделения чистых культур микроорганизмов?

4. Почему бактериологический метод диагностики является основным при диагностике инфекционных заболеваний?

5. Назовите основную схему бактериологического исследования.

6.Чем определяется длительность бактериологического исследования?