Методические указания:

Сложные методы окраски используют для выявления различных компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов окрашивания в отличии от простых используется не менее двух различных красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.

Окраска по методу Грама:

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель – генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин.

2. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек.

4. Промыть водой.

5. Нанести раствор водного фуксина на 1-2 мин.

6. Промыть водой, высушить.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные в красный. Принцип метода заключается в том что генциановый фиолетовый связывается с пептидогликаном клеточной стенки. Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя. Тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются. А грамположительные микрооганизмы остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет.

Окраска по Граму имеет дифференциально-диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки и др., к грамотрицательным – гонококки, кишечная палочка, менингококки и др. Некоторые виды окрашиваются по Граму вариабельно в зависимости от различных внешних и внутренних факторов.

Для правильной окраски следует соблюдать технику окрашивания.

Контрольные вопросы:

1.Назовите основные морфологические формы бактерий.

2 Каково строение клеточной стенки бактериальной клетки?

3.Каковы основные отличительные признаки Гр(-) и Гр(+) микроорганизмов?

4. Каково значение сложных методов окрашивания при диагностике инфекционных заболеваний?

5. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов по методу Грама.

Д.З. Заполнить таблицу

Структура бактериальной клетки

органоид	функция	Методы выявления

Список литературы:

Обязательная:

1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.

3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология , вирусология , иммунология. СпецЛит, 2000 г

4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.

2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 3 Строение бактериальной клетки. Сложные методы окраски.

Цель: Изучить строение бактериальной клетки, функции и методы выявления отдельных органоидов. Научиться окрашивать мазки по методу Циля-Нильсена, Бурри и Бурри-Гинса, Нейссера, Ожешко.

Знать: Особенности морфологии и ультраструктуры бактериальных клеток.

Уметь: Приготовить мазок, окрасить его сложным методом, осуществить микроскопию с помощью иммерсионного микроскопа, описать морфологию и отдельные особенности ультраструктуры клеток бактерий.

Обоснование темы: Строение бактериальной клетки имеет важное значение для классификации бактерий и используется для бактериоскопического метода диагностики некоторых инфекционных заболеваний

Вопросы для самоподготовки:

1. Отличительные черты клеток прокариотов от клеток эукариотов.

2. Облигатные компоненты клеток прокариотов

3. Факультативные компоненты клеток прокариотов.

4. Методы изучения структуры бактериальных клеток и их практическое значение.

5. Бактериоскопический метод диагностики. Его достоинства и недостатки.

ПЛАН

Программа:

1. Ультраструктура бактериальных клеток

2. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама

3. Сложные методы окраски (методы Ожешко, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Нейссера )

Демонстрация:

1. Капсула бактерий (окраска по методу Бурри-Гинса)

2. Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза в мокроте (окраска по методу Циля-Нильсена)

3. Спорообразующие бактерии (окраска по методу Ожешки)

4. Зерна волютина у коринебактерий дифтерии (окраска по методу Нейссера)

Задание студентам:

1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в готовом препарате (окраска по методу Грама). Зарисовать.

2. Самостоятельно приготовить мазки из культур кишечной палочки и стфилококка, окрасить по методу Грама, микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическм признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.

4. Микроскопировать и зарисовать:

- капсулы клебсиелл (окраска по методу Бурри и Бурри-Гинса)

- коринебактерии дифтерии, содержащие зерна валютина (окраска по методу Нейссера)

- кислотоустойчивые микобактерии (окраска по методу Циля-Нильсена)

- споры бацилл сибирской язвы (окраска по методу Ожешки)