ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

КАФЕДРА «МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ»

Н. Н. Митрофанова

В.Л. Мельников

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ.

Учебно-методическое пособие

для студентов медицинских вузов

ПЕНЗА 2012

Учебно-методическое пособие для студентов медицинских вузов «Общая микробиология» составлено в соответствии с программой для студентов 2 – 3 курса по медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии 2002 г.

По каждой теме сформулирована цель занятия. Имеется план и методика выполнения различных экспериментальных работ с микроорганизмами. Приведены современные методы диагностики различных инфекций.

Руководство рекомендовано для самостоятельной подготовки студентов к практическим занятиям.

Занятие № 1 Бактериологическая лаборатория и оборудование рабочего места. Техника безопасности при работе в лаборатории. Устройство современных микроскопов. Морфология бактерий и методы ее изучения.

Цель: Изучить и научиться выполнять правила противоэпидемического режима в бактериологической лаборатории,

Научиться готовить фиксированный препарат, окрашивать его простым методом и изучать при помощи иммерсионного микроскопа.

Знать: основные задачи медицинской микробиологии, устройство, оснащение, режим работы, с оборудование и материалы различных лабораторий, правила работы в них, типы микроскопов, основные принципы классификации микроорганизмов

Уметь: подготовить иммерсионный микроскоп к работе, приготовить мазок, окрасить его с помощью простых методов окраски, осуществить микроскопию с помощью иммерсионного микроскопа. Описать морфологию бактерий в мазке по схеме. Приготовить нативный препарат, определить подвижность микроорганизмов.

Обоснование темы: все работы с микроорганизмами проводятся в специализированных лабораториях, в которых необходимо использовать определенные правила по технике безопасности и специфические приемы для работы с патогенными биологическими агентами

Вопросы для самоподготовки:

1. Предмет и задачи медицинской микробиологии

2. История развития микробиологии.

3. Основные принципы классификации микроорганизмов.

4. Оснащение и режим работы бактериологической лаборатории

5. Типы микроскопов и методы микроскопии

6. Строение механической и оптической части микроскопа.

7. Понятие о простых методах окраски.

8. Принципы классификации микроорганизмов.

ПЛАН

Программа:

1. Правила по технике безопасности.

2. Классификация лабораторий и основное оборудование.

3. Морфология бактерий и методы ее изучения.

4. Типы микроскопов и их устройство.

5. Этапы приготовления фиксированного мазка из бактерий.

6. Приготовление нативных препаратов для прижизненного изучения микроорганизмов.

7. Простые методы окраски препаратов.

8. Основные принципы классификации микроорганизмов.

Демонстрация:

1. Приготовление мазков из бактериальных культур

2. Подвижность бактерий в препарате «висячая» капля

3. Подвижность бактерий в препарате «раздавленная» капля

4.Красители, используемые в микробиологии

Задание студентам:

1. Освоить методы работы с иммерсионным микроскопом.

2. Микроскопировать и зарисовать готовые мазки, окрашенные простым методом, описать морфологию бактерий в мазке по схеме, зарисовать (стафилококки, диплококки, стрептококки, сарцины, палочки, клостридии, стрептобациллы, вибрионы, спирохеты, актиномицеты)

3. Приготовить мазки из бактерий. выращенных на жидкой и плотной питательной средах.

4. Окрасить мазки простым методом. Зарисовать, определив принадлежность к морфологическому типу.

5. Приготовить нативные препараты методом «висячая» капля и «раздавленная» капля. Определить подвижность микроорганизмов.

Информационный материал.

Лаборатория – организация, в которой выполняются экспериментальные, диагностические производственные работы с патогенными биологическими агентами (ПБА).

ПБА – патогенные для человека микроорганизмы (бактерии, вирусы, хламидии, риккетсии, простейшие, грибы, микоплазмы) а также генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы, яды биологического происхождения 9токсины, гельминты, биологические материалы, подозрительные на содержание вышеперечисленных агентов.

Все микробиологические, биохимические, молекулярно-биологические исследования микроорганизмов проводят в специальных лабораториях, структура и оборудование которых зависят от объектов исследования и от целевой направленности (научные исследования, диагностика заболеваний, изучение иммунного ответа и серодиагностика заболеваний человека и животных) осуществляется в иммунологических и серологических лабораториях.

Бактериологические, вирусологические, микологические и серологические лаборатории входят в состав центров Роспотребнадзора, диагностических центров и крупных больниц.

В лабораториях Роспотребнадзора выполняют бактериологические, вирусологические, серологические, паразитологические анализы материалов, полученных от больных и контактировавших с ними лиц, обследуют бактерионосителей и производят санитарно-микробиологические исследования воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и т.д.

В бактериологических и серологических лабораториях больниц и диагностических центров производят исследования с целью диагностики кишечных, гнойных, респираторных и др. инфекционных заболеваний, осуществляют микробиологический контроль за стерилизацией и дезинфекцией.

Диагностику карантинных и особо опасных инфекций (чума, туляремия, сибирская язва и др.) проводят в специальных лабораториях, организация и порядок деятельности которых строго регламентирован.

В вирусологических лабораториях диагностируют заболевания, вызванные вирусами (грипп, полиомиелит, и т.п.), некоторыми бактериями – хламидиями (орнитоз) риккетсиями (сыпной тиф). При организации и оборудовании вирусологических лабораторий учитывают специфику работы с вирусами, культурами клеток и куриными эмбрионами, требующую строжайшей асептики.

В микологических лабораториях проводят диагностику заболеваний, вызванных патогенными грибами – возбудителями микозов.

Лаборатории обычно размещаются в нескольких помещениях, площадь которых определяется объемом работ и целевым назначением. В каждой лаборатории предусмотрены: боксы для работы с отдельными группами возбудителей, помещения для серологических исследований, помещения для мойки и стерилизации посуды. Приготовления питательных сред, виварий с боксами для здоровых и подопытных животных, регистратура для приема и выдачи анализов.

Требования, предъявляемые к бактериологическим лабораториям:

1. Все бактериологические лаборатории должны иметь разрешение на работу с ПБА

2. Лаборатория должна размещаться в отдельном здании или в изолированной части здания

3. Лаборатория должна иметь 2 входа: для сотрудников и для доставки патологического материала

4. Исходя из требований бактериологической безопасности, лаборатория должна иметь: водопровод, канализацию, вентиляцию, освещение (естественное, искусственное), отопление

5. Все помещения лаборатории делятся на две зоны: «заразная» и «чистая» где не проводятся работы с ПБА.

«Чистая» зона должна включать:

Гардероб, комнату отдыха, комнату для работы с документами, кабинет заведующего, подсобные помещения, моечную, комнату для приготовления питательных сред, препараторскую, стерилизационную.

«Заразная» зона должна включать: помещения для приема, регистрации, сортировки материала, боксированные помещения, боксы биологической безопасности, комнату для проведения бактериологических исследований, комнату для проведения серологических исследований, комнату для проведения гельминтологических исследований, термостатную (не во всех лабораториях), автоклавную.

Отличие боксированных помещений от боксов:

Боксированные помещения осуществляют защиту исследуемого материала от вторичного инфицирования, боксы предназначены для защиты от ПБА персонала и окружающей среды, в связи с чем они имеют автономные системы коммуникаций.

Группы возбудителей инфекционных заболеваний:

1. Возбудители особо опасных инфекций: чумы, натуральной оспы, лихорадки Ласса, Эбола.

2. Возбудители высококонтагиозных бактериальных, грибковых, вирусных инфекций: сибирская язва, холера, сыпной тиф, бешенство

3. Возбудители бактериальных, грибковых, вирусных, протозойных инфекций, выделенных в отдельные нозологические группы: коклюш, столбняк, ботулизм, туберкулез, кандидоз, грипп, полиомиелит

4. Возбудители бактериальных, грибковых, вирусных септицемий, менингитов, пневмоний, энтеритов (возбудители анаэробных клостридиальных инфекций, синегнойная инфекция, герпесвирусы, возбудители амебиаза)

Оборудование бактериологической лаборатории.

Микроскоп. Изучение морфологии микроорганизмов производится с помощью различных микроскопов, увеличение которых колеблется от 500 до 1000 раз.

Для микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии (фазово-контрастный, темнопольный) применяются различные марки микроскопов «Биолам», МБР -1 и т. д.

Микроскоп (от греческих слов micros — малый, skopeo — смотрю) — оптический прибор для изучения малых объектов, недоступных невооруженному глазу. Разрешающая способность оптического микроскопа равна 0,2 мкм, полезное увеличение 1 000

В микроскопе различают механическую и оптическую часть.

В механическую часть микроскопа входят - штатив, состоящего из основания и тубусодержателя, тубус с револьвером для объективов, предметный столик для микропрепаратов.

В тубус микроскопа сверху вставлен окуляр. В штатив встроены механизмы грубого (макровинт) и тонкого (микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительной системы, объективов, окуляров и конденсора.

Осветительная система находится под предметным столиком и состоит из зеркала и конденсора с диафрагмой.

Зеркало служит для отражения световых лучей по направлению к объективу и внутрь микроскопа. Одна сторона зеркала плоская, другая вогнутая. При дневном свете пользуются плоским зеркалом, при искусственном освещении — вогнутым.

Конденсор состоит из системы линз, предназначенных для собирания лучей, идущих от зеркала, в одной точке — фокусе, который должен находиться в плоскости рас­сматриваемого препарата. При микроскопировании с дневным светом конденсор должен быть поднят до уровня предметного столика; при искусственном освещении конденсор опускают до тех пор, пока при малом увеличении изображение источника света не появится в плоскости препарата. При изучении неокра­шенных объектов следует опускать конденсор.

Объем лучей регулируется диафрагмой, находящейся под конденсором. Окрашенные препараты рассматриваются при от­крытой диафрагме; при рассматривании неокрашенных объектов следует уменьшить диаметр отверстия диафрагмы.

Объектив - основной оптический элемент микроскопа. Он представляет собой си­стему линз, заключенных в металлическую оправу.

Увеличение объектива зависит от фокусного расстояния, а следовательно, и от кривизны фронтальной линзы. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива.

Все объективы разделяются на сухие и иммерсионные. Сухим называют такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассматриваемым препаратом находится воздух. При этом ввиду разницы показателей преломления стекла и воздуха, часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя.

При исследовании микробов применяется иммерсионная система. Ее преимущество перед сухими объективами состоит в том, что между стеклом и линзой устанавливается однородная среда (стекло препарата — масло — стекло объектива) с одинаковым показателем преломления. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя своего направления, попадают в объектив, чем я достигается наилучшее освещение.

Разрешающая способность – возможность различать раздельно две близко расположенные точки. Для оптического микроскопа она равна 0,2 мкм. Для проведения иммерсионной микроскопии обычно пользуются кедровым маслом, показатель преломления которого почти равен показателю преломления стекла. При этом капля масла помещается на стекло препарата и в нее погружается иммерсионный объектив.

Окуляры имеют две линзы: верхнюю и нижнюю. Расстояние между линзами, равно полусумме их фокусных расстояний. Таким образом, по длине окуляра можно приблизительно определить общее фокусное расстояние. На окуляре указано значение его увеличения. Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра.

Окуляр дает только увеличение, объектив раскрывает качество изображения.

Электронный микроскоп.

В 1932 г. был изобретен электронный микроскоп, в котором вместо световых лучей используется поток электронов. При электронной микроскопии возможно рассматривать объекты, размер которых в 50—100 раз меньше видимых в обыкновенном микроскопе.

Увеличение даваемое электронным микроско­пом, равно 20000-40000 раз. При последующем оптическом увеличении в 4—5 раз можно получить полезное увеличение в. 100000—200000 раз.

По расположению линз и ходу лучей электронный микроскоп очень похож на проекционный оптический микроскоп. В зависимости от того, из каких линз собран микроскоп, различа­ют электростатические и электромагнитные микроскопы. Источником электронов в этом приборе является электронная пушка (электронно-лучевая трубка с ка­тодом, состоящим из раскаленной нити, и анодом-цилиндром). Вылетевшие из нити электроны разгоняются высоким электрическим напряжением (50 000— 100000 V). Вышедший из электронной пушки пучок электронов попадает в конденсорную электромагнитную линзу, которая сводит их на рассматриваемый предмет, лежащий на тонкой (1/1000000 см) пленке коллодия. После этого лучи попадают на объективную электромагнитную линзу, собирающую расходящиеся лучи и дающую первое (промежуточное) увеличение предмета.

Это изображение можно наблюдать на специальном промежуточном экране. В центре последнего сделано маленькое отверстие (апертурная диафрагма). Небольшая часть первого увеличенного изображения, равная отверстию промежуточного экрана, служит “предметом” для дальнейшего увеличения. Поток электронов через это отверстие попадает на проекционную электромагнитную линзу, снабженную апертурной диафрагмой. Второе увеличенное изображение, даваемое проекционной линзой, принимается на флюоресцирующий экран или на фотографическую пластинку Можно прибегнуть также к последующему оптическому увеличению.

С помощью электронной микроскопии удалось получить замечатель­ные результаты в области микробиологии: обнаружить многие важные особенности и детали морфологии микроорганизмов (морфология вирусов и бактериофага и др.).

Виды микроскопии

1. Светлопольная микроскопия (микроскопия в проходящем свете) используется для изучения окрашенных объектов в фиксированных препаратах

2. Темнопольная микроскопия

Применяется для прижизненного изучения микроорганизмов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости (эффект Тиндаля) Эффект достигается с помощью специального конденсора (парабалоид или кардиоид), которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе. При этом способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенное поле зрения) видны ярко освященные частицы. Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и центрируют, как и для светлого поля, заменяют конденсор на специальный, прибавляют свет до максимума, открывают конденсор до максимума. Для темнопольной микроскопии готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля»

3. Люминесцентная микроскопия.

Люминесценция – способность некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой длиной волны (например, таким свойством обладают ультрафиолетовые лучи). Объект, не видимый в ультрафиолетовом излучении, приобретает яркий блеск после обработки специальными веществами – флюорохромами.

Установка для люминесцентной микроскопии состоит из источника света с сине-фиолетовым фильтром и микроскопа. На окуляр микроскопа надевают желтый светофильтр.

Преимущества люминесцентной микроскопии:

1.цветное изображение

2.высокая степень контрастности объектов

3.возможность исследования непрозрачных объектов

4.возможность исследования динамики жизненных процессов

5.обнаружение локализации отдельных микроорганизмов, вирусов

6.развитие методов цитогистохимии, экспрессная цитодинамика.

Фазово-контрастная микроскопия

Предназначена для нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть прозрачные объекты. Свет проходит через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое простым глазом. Фазовое устройство состоит из особого конденсора и объектива и обеспечивает преобразование изменение фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом достигается усиление различий в оптической плотности объектов.

Для фазово-контрастной микроскопии используется обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство КФ-1, КФ-4 и специальные осветители.