- •Занятие № 1 Бактериологическая лаборатория и оборудование рабочего места. Техника безопасности при работе в лаборатории. Устройство современных микроскопов. Морфология бактерий и методы ее изучения.
- •Электронная микроскопия.
- •Список литературы:
- •Занятие № 2 Морфология бактерий. Тинкториальные свойства бактерий. Окраска по методу Грама.
- •Методические указания:
- •Список литературы:
- •Информационный материал.
- •Список литературы:
- •Занятие № 4 Физиология микроорганизмов.Бактериологический метод диагностики.Питание бактерий. Питательные среды. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
- •Информационный материал.
- •Список литературы:
- •Занятие № 5 Физиология микроорганизмов. Биохимические свойства микроорганизмов.
- •Методические указания:
- •Список литературы:
- •Занятие № 6 Физиология микроорганизмов. Дыхание микроорганизмов. Анаэробы. Методы культивирования. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Дезинфекция. Стерилизация.
- •Методические указания:
- •Список литературы:
- •Занятие № 7 Антагонизм микробов и антибиотики.
- •Информационный материал
- •Список литературы:
- •Занятие №8 Бактериофагия.
- •2. Работа с развивающимися куриными эмбрионами
- •3. Работа с культурами клеток
- •1.Классификация бактериофагов по морфологическому строению:
- •2.Классификация бактериофагов по характеру взаимодействия с микробной клеткой.
- •Список литературы:
- •Занятие № 9 Генетика микроорганизмов.
- •Информационный материал.
- •Список литературы:
- •Занятие № 10. Контрольное занятие по теме «Морфология и физиология микроорганизмов».
- •Список литературы:
Список литературы:
Обязательная:
-
Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
-
Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
-
Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология , вирусология , иммунология. СпецЛит, 2000 г
-
Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
-
Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
-
Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
-
Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982
Занятие № 9 Генетика микроорганизмов.
Цель: Ознакомиться с особенностями наследственности, видами изменчивости микроорганизмов, теоретическим и практическим значением генетики микроорганизмов, с современными методами генетических исследований и использованием их в медицинской практике.
Знать: Строение генома бактерий, виды изменчивости микроорганизмов, практическое применение методов генетики в народном хозяйстве, медицине.
Уметь: осуществлять постановку экспериментов по выявлению различных видов изменчивости.
Обоснование темы: для идентификации микроорганизмов применяют многие молекулярно-генетические методы, что значительно ускоряет постановку правильного диагноза.
Вопросы для самоподготовки:
1.Материальная основа наследственности.
2.Понятие о генотипе и фенотипе бактерий.
3.Виды изменчивости.
4. Классификация мутаций.
5. Репарации поврежденной ДНК.
6. Генетические рекомбинации у бактерий, механизмы и значение.
7. Классификация и роль плазмид.
8. ПЦР и ДНК-зонды, их применение.
ПЛАН
Программа:
1. Модификационная изменчивость. Пигментообразование при разных температурах. О и Н- формы при росте на МПА и среде Плоскирева.
2. Мутационная изменчивость.
3. Рекомбинантная изменчивость. Постановка опытов по трансформации, трансдукции и конъюгации.
4. Применение методов генетики в медицине.
Демонстрация:
1. Опыт по пигментообразованию.
2. Рост протея на МПА и среде Плоскирева.
3. Диссоциация энтеробактерий на различные формы колоний.
4. Эксперимент по различным видам рекомбинаций.
Задание студентам:
1.Заполнить таблицу: Классификация и функции плазмид.
2. Заполнить таблицу: Молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики.
3. Описать различные виды колоний энтеробактерий при диссоциациях.
4.Учесть результаты опытов, поставленных с целью выявления трансдукции, трансформации и коньюгации. Сделать заключение.
Информационный материал.
Ген – структурная и функциональная единица наследственной информации, участок ДНК, контролирующий синтез определенного белка.
Геном - совокупность генов гаплоидного набора хромосом клетки.
Амплификация - увеличение числа копий генов / часто плазмид молекулярным весом / в клетке.
Элиминация - удаление генов из клетки / особенно плазмид под действием УФ, акридиловых красителей/.
Траспозоны - участки ДНК, способные к перемещению внутри молекулы и от одной к другой, могут быть переданы из клетки в клетку.
Is – последовательности - нуклеотидные последовательности, не кодирующие выработку белка, а ответственные за встраивание транспозонов в молекулу ДНК.
Мутация - изменение генотипа.
Сексдуция - перенос фрагмента хромосомы F – фактора при конъюгации.
Трансдуцирующий фаг - умеренный фаг, который переносит бактериальные гены от донора к реципиенту.
Фактор компетенции - особый белок, создающий условия для трансформации в клетке.
Генетический аппарат бактерий имеет ряд особенностей организации.
Особенности генетического аппарата бактерий:
а/ цитологические:
-
Наследственный аппарат бактерий представлен нуклеоидом;
-
В отличие от ядра нуклеоид не имеет ядерной мембраны;
-
В нуклеоиде нет ядрышек;
-
В нуклеоиде одна хромосома;
-
В бактериальной клетке может быть дополнительное наследственное вещество – плазмида;
-
Молекула ДНК хромосомы и плазмиды прикрепляются к ЦПМ.
б/ молекулярные:
-
Хромосома бактерий имеет кольцевую структуру;
-
Хромосома бактерий – чистая двунитчатая ДНК, не содержит гистонов;
-
В ДНК бактерий повышенное содержание метиллированных / минорных / азотистых оснований, или выполняют защитную функцию гистонов;
-
ДНК бактерий содержит is – последовательности, строение которых аналогично таким же участкам ДНК у высших организмов;
-
Отмечается выраженная изменчивость нуклеотидного состава:
Соотношение гуанина и цитозина /Г/Ц – индекс/ у бактерий имеет видовые отличия.
Важное место в генетике бактерий занимают плазмиды – дополнительные, внехромосомные элементы наследственности / внехромосомная молекула ДНК, гены которой отвечают за ряд селективных свойств и способен к автономной репликации.
Плазмида, как и хромосома, представлена кольцевой двунитчатой ДНК, но ее размеры значительно меньше хромосомы. Плазмида содержит структурные гены, кодирующие тот или иной признак, гены автономной репликации, is – последовательности. У некоторых плазмид есть гены, ответственные за ее трансмиссивность / перенос, передачу/. Такие плазмиды называются трансмиссивными / конъюгативными/.
Основные свойства плазмид:
-
Гены плазмид несут не обязательную для клетки информацию, а лишь сообщают ей селективные преимущества; без плазмид клетка существовать может, а без хромосомы нет;
-
Плазмидная ДНК имеет значительно меньшую молекулярную массу, чем хромосомная;
-
Плазмиды способны к автономной репликации или их репликация находится под ослабленным контролем хромосомы;
-
Для плазмид с низкой молекулярной массой характерно явление амплификации / многопийности/;
-
Некоторые плазмиды /F, R – факторы/ способны находиться как в автономном, так и интегрированном с хромосомой состоянии; штаммы, у которых F- фактор интегрирован с хромосомой, - H¦r – штаммы;
-
Молекула ДНК плазмид более подвержена воздействию физических и химических агентов, чем хромосомы; частота плазмидных мутаций выше, чем хромосомных;
-
Некоторые физические /УФ, СВЧ и др./ и химические / акридиловые красители/ агенты вызывают алиминацию / удаление, потерю / плазмид;
-
Плазмиду могут содержать tra – гены и самостоятельно передаваться в процессе конъюгурации, это конъюгативные плазмиды; частота передачи плазмидных генов выше, чем хромосомных; трансмиссионность /передача, перенос / плазмид может быть связан и с переносом их в клетки умеренными трансдуцирующими фагами;
-
В клетке могут находится несколько разных плазмид, но некоторые плазмиды несовместимы между собой; по этому признаку различают группы несовместимости плазмид.
Плазмиды могут детерминировать разные свойства бактерий. Различают:
-
R – плазмиды – кодируют лекарственную устойчивость;
-
F – плазмиды – определяют пол бактерий;
-
Col – плазмиды – детерминируют синтез бактериоцинов;
-
Hlj - плазмиды – кодируют синтез гемолизинов;
-
Ert – плазмиды – детерминируют синтез энтеротоксина;
-
Плазмиды биодегративные – обуславливают расщепление сложных ароматических и других соединений, например, нефти, парафина, ПАВ и др.
Плазмиды играют важную роль в процессах рекомбинации /обмена генетической информации/ у бактерий.
У бактерий имеется 2 типа изменчивости: фенотипическая и генотипическая. Фенотипическая изменчивость (модификации)- это изменение внешних признаков, не затрагивающее генотип.
Фенотип- совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития; фенотип определяется взаимодействием генотипа с условиями окружающей среды.
Генотипическая изменчивость затрагивает не только фенотип но и генотип - совокупность всех генов клетки.
Проявлениями фенотипической изменчивости у бактерий являются модификации: кратковременные / в пределах одного поколения/ и длительные/ сохраняются в поколениях/.
Отличия длительной модификации от мутации
-
Отсутствие изменений в структурных генах генотипа;
-
Приобретение новых свойств большим числом особей в популяции;
-
«Затухание» /исчезновение/ признака в ряду поколений.
Примером фенотипической изменчивости бактерий является диссоциация - расщепление признака при изменении условий культивирования: переход форм с гладкими колониями в Р – формы с шероховатыми колониями, потеря пигмента, появление неподвижных вариантов у подвижных бактерий и т.д.
Генотипическая изменчивость бактерий связана с мутациями и рекомбинациями. /см. словарь основных терминов/.
Мутации у бактерий могут быть спонтанные и индуцированные известным мутагеном. По локализации различают: а/ генные – затрагивают один ген; б/ хромосомные – затрагивают группу генов; в/ плазмидные – затрагивают гены плазмид.
Механизм мутаций Вам известен. Это: а/ делеция – потеря гена или участка ДНК; б/ дупликация – удвоение генетического фрагмента; в/ транспозиция – изменение положения гена; г/ инверсия – переворот участка ДНК на 180°; д/ вставка нового гена.
Фенотипическое проявление мутаций чаще ведет к потере признака – прямая мутация или к его восстановлению – обратная мутация. Так как у бактерий одна хромосома, то частота фенотипических проявлений мутаций высока, а делеция большого участка хромосомы летальна для бактерий.
Вторым механизмом генотипической изменчивости у бактерий являются рекомбинации. - перераспределение генетического материала родителей в потомстве / обмен генетического материала, приводящий к появлению новых сочетаний генов/.
Особенности рекомбинации у бактерии:
-
Однонаправленность переноса генетической информации /от донора к рецепиенту/;
-
Неодинаковое долевое участие генома и реципиента в образовании рекомбинанта /реципиентный геном полностью переходит к рекомбинанту, а от донора только отдельные гены, плазмиды/;
-
В результате рекомбинации образуется мерозигота /частичная зигота/;
-
Наличие нескольких механизмов рекомбинаций: конъюгация, трасформация, трансдукция, слияние протопластов.
Механизмы рекомбинации:
-
Конъюгация – перенос генетической информации при непосредственном контакте донора и реципиента. Это аналог полового процесса у бактерий. Поло у бактерий определяет F – плазмиды: в «мужских» клетках /F+/ она есть, в «женских» /F-/ - отсутствует.
Отличия f+ b f- клеток
-
У F+ клеток есть дополнительная генетическая информация /F – фактор/;
-
F+ клетки имеют на поверхности специальные ¦ - пили, обеспечивающие контакт при конъюгации;
-
F+ клетки имеют дополнительный ¦i – антиген / белок ¦ - пилей/;
-
F+ и F- клетки отличаются поверхностным зарядом;
-
F+ клетки чувствительны к «мужским» фагам, которые не адсорбируются на F- клетках;
-
F+ клетки обладают свойствами донора/отдают генетическую информацию/, а F- клетки – свойствами реципиента /воспринимают генетическую информацию/. Как уже указывалось, рецепиентные клетки участвуют в образовании рекомбинанта всем своим геномом, а донор передает свою генетическую информацию лишь частично. Чаще это конъюгативные плазмиды, но H¦r – штаммы /см. словарь основных терминов/ передают с высокой частотой хромосомные гены при коньюгации.
II. Трансдукция – перенос генетической информации от донора к рецепиенту с помощью трансдуцирующего фага. Трандуцирующий фаг – это умеренный фаг, при который при индукции дизогенной культуры захватывает соседние бактериальные гены и при инфицировании новых клеток вносит в них эти гены.
При строгой специфичности локуса интеграция умеренного фага с хромосомой лизогенной клетки /например, для фага l - рядов с lас – опероном, для фага Р – рядов с trp – опероном и т.д./ при индукции захватываются и переносятся всегда строго определенные гены – это специфическая трансдукция. Перенос случайных бактериальных генов умеренным фагом – общая трансдукция. Захват случайных бактериальных геновы может происходить при сборке фагов или в том случае, каогда профаг не имеет строго определенного локуса в геноме бактерий.
Изменение свойств бактерий, инфицированных умеренным фагом, может происходить и под действием генов самого фага – явление фаговой, или лизогенной конверсии.
Отличия трансдукции от фаговой конверсии:
-
Приобретение новых свойств при трансдукции идет за счет бактериальных генов, а при фаговой конверсии – за счет фага.
-
Частота трансдукции значительно ниже частоты фаговой конверсии.
-
Трансформация – передача генетической информации при культивировании реципиента на среде с ДНК донора.
Трансформация возможна у близкородственных бактерий. Реципиент получает не всю молекулу ДНК донора, а ее отдельные фрагменты. Реципиенты клетки должны быть в состоянии компетентности. У клетки, готовой воспринять генетическую информацию, обнаруживается особый белок – фактор компетентности. Его действие связывают: а/ с повышением проницаемости клеточной стенки и ЦПМ для ДНК, б/ с ингибированием ДНК-аз, в/ с активированием синтеза и рестриктаз. Это состояние наблюдается в процессе деления клетки. Когда она активно строит свою ДНК, то в этот момент могут быть захвачены фрагменты чужой ДНК. In vivo в популяции часть клеток всегда активно размножается, а часть погибает, то есть имеются условия для трансформации. In vitro эти условия создают искусственно.
Молекулярно-биологические методы идентификации
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Принцип метода:
Исследуемый материал подвергается специальной обработке, при которой происходит лизис клеток с выходом ДНК. Часть материала переносится в пробирку, содержащую смесь мононуклеотидов, ДНК-полимеразу и праймер – уникальную последовательность нуклеотидов, присущую искомому возбудителю. Циклическое изменение температуры ( 30 циклов) позволяет осуществить репликацию определенного возбудителя. Этот процесс называется амплификацией, в результате которого количество специфической ДНК увеличивается в миллионы раз. Такие количества ДНК могут быть выявлены с помощью электрофореза в агаровом геле. Преимуществами метода ПЦР являются:
-
Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК микроорганизмов, так и к ДНК человека.
-
Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР определяется уникальный участок гена, характерный только для данного возбудителя. Для повышения специфичности возможно определятьнесколько разных генов одного микроба. Так, например, для определения Ureaplasma urealyticum можно выявлять как ген 16S-RNA, так и ген уреазы. А для идентификации Chlamydia trachomatis, помимо определения хромосомальной ДНК и ДНК криптической плазмиды сталовозможным выявлять рибосомальную РНК (NASBA). Это значительно повышает достоверность исследования.
-
Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это значительно превышает чувствительность культуральных методов исследования.
-
Малый объем биологического материала. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в педиатрии, неонатологии, неврологии, судебной медицине.
-
Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях.
Недостатки метода ПЦР
-
Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПНР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Однако, метод выявляет РНК только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений.
-
Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно-патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR).
3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей
ДНК зондирование.
Принцип метода: Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов – фрагментов ДНК, комплементарных уникальным участкам микробного генома и несущих метку ( радионуклид, фермент или флюорохром ) . Включение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими.
Сазернблоттгшг (гибридизация по Сазену) - выявление участка ДНК путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом и фиксированных на мембране фрагментов искомой ДНК с мечеными комплементарными ДНК-зондами. Сначала с помощью гель-электрофореза разделяют фрагменты ДНК. После электрофореза гель переносят в щелочной раствор для получения из двунитевой ДНК однонитевых фрагментов. Затем фрагменты ДНК переносят из геля на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембраны и гибридизируют со специфической меченой пробой ДНК (комплементарным олигонуклеотидным зондом, меченным радионуклидом или флюо-рохромом). Неспецифически связанные молекулы зонда отмываются, а меченые участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография), на которой проявляются полосы меченого зонда ДНК. Зонды, меченные флюорохромом, выявляют при помощи люминесцентной микроскопии. Нозернблоттинг применяют для выявления и гибридизации РНК (фрагментов РНК). В этом методе размер и количество специфических молекул и РНК определяются после обработки общей РНК или поли(А)РНК. Молекулы РНК выделяют гель-электрофорезом и переносят на иммобилизованную мембрану. Искомые последовательности РНК определяют гибридизацией с меченой пробой.
ДНК- ДНК -гибридизация
ДНК-ДНК-гибридизация основана на денатурации, т.е. разделении двунитевой ДНК на отдельные нити в щелочной среде при температуре около 90 °С и последующем восстановлении (отжиге) двунитевой структуры с комплементарной меченой нитью ДНК (молекулярным зондом) при понижении температуры до 10-37 °С. Гибридизацию часто проводят на фильтрах (блот-гибридизация), или in situ. Молекулярный зонд с присоединенным биотином гиб-ридизируется на ДНК-мишени. После отжига и промывки на образец наносят антибиотиновый конъюгат (стрептавидин, соединенный с щелочной фосфатазой) и проводят специфическое окрашивание клеток. Стрептавидин можно метить, кроме щелочной фосфатазы, флюорохромами. Стрептавидин с меткой избирательно связывается биотином, что выявляется при микроскопии. Так выявляют локализацию микробов в ткани, хромосомные аномалии в клетках и т.д.
Риботипирование
Риботипирование - выявление количественных различий по рибосомным оперонам и нуклеотидным последовательностям. Проводят гидролиз ДНК, которую разделяют в агарознок; геле и затем гибридизируют с ДНК-зондами на один или более генов, кодирующих 16S-, 23S-, 58-рибосомные РНК. Бактерии можно типировать по серотипу, фаготипу и по риботипу. Методически сходно с рибо-типированием IS-типирование: проводят сравнительный анализ числа копий IS-элементов и рестрикционного разнообразия нуклеотидных последовательностей различных штаммов микробов.
Рестрикционный анализ
ДНК расщепляют с помощью рестриктаз (бактериальных эндонуклеаз), которые распознают и разрывают определенные последовательности нуклеотидов в нужных участках. Отдельные рестриктазы способствуют вьщелению строго определенных фрагментов ДНК. Размер полученных фрагментов ДНК можно определить путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. После электрофореза каждый фрагмент ДНК располагается в определенном участке геля в виде дискретной полосы. Фрагменты ДНК выявляют путем обработки геля бромидом этидия, который связывается с ДНК. Такие фрагменты ДНК высвечиваются при ультрафиолетовом облучении в красной области спектра. Длину каждого фрагмента можно выявить, сравнивая расстояние, пройденное фрагментом ДНК при электрофорезе, с расстоянием, пройденным стандартным фрагментом ДНК известного размера.
Методические указания:
Таблица: Классификация и функции плазмид.
Название плазмид |
Функции плазмид |
|
|
Таблица: Молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики.
Название метода |
Достоинства метода |
Недостатки метода |
|
|
Контрольные вопросы:
1.Чем отличается строение генома бактерий от клеток эукариотов ?
2. Что такое рекомбинации и каковы их основные виды?
3. Каково значение плазмид?
4. Какие достоинства и недостатки имеются у метода ПЦР?
5. Назовите основные методы внутривидового типирования микроорганизмов.