- •1. Общая микробиология
- •1.1 Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования
- •1.2. Противомикробные мероприятия
- •1.3.Классификация питательных сред
- •1.4.Культуральный метод исследования
- •1.5. Методы выделения чистых культур микроорганизмов
- •1. Метод механического разобщения микроорганизмов:
- •2. Метод заражения чувствительных лабораторных животных (биологический):
- •3. Методы, основанные на избирательной чувствительности микроорганизмов к воздействию внешних факторов:
- •1.6. Определение биохимических свойств микробов
- •1.11. Биологический (экспериментальный) метод исследования
- •1.12. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
- •1.13. Методы генетического анализа микроорганизмов
- •1.14. Методы изучения нормальной микрофлоры
- •2. Частная микробиология
- •2.1. Микробиологическая диагностика пневмококковых инфекций
- •II. Культуральный (бактериологический) метод:
- •2.2. Общие принципы диагностики острых кишечных
- •2.3 Диагностика кишечных эшерихиозов (колиэнтеритов)
- •2.4. Диагностика брюшного тифа, паратифов а и в, сальмонеллезов
- •2.5. Лабораторная диагностика кишечного иерсиниоза
- •2.6. Клебсиеллы. Лабораторная диагоностика склеромы и озены
- •2.7. Лабораторная диагностика холеры
- •2.8. Кампилобактерии. Методы диагностики кампилобактериоза
- •2.9. Диагностика пищевых отравлений бактериальной природы
- •2.10. Лабораторная диагностика газовой гангрены
- •2.11. Лабораторная диагностика столбняка
- •2.12. Лабораторная диагностика ботулизма
- •2.13. Серологическая диагностика сифилиса
- •2.14. Лабораторная диагностика хламидиозов
- •2.15. Микоплазмы, микоплазмозы
- •3. Общая и частная вирусология
- •3.1. Методы культивирования вирусов
- •I. Культуры клеток
- •3.2. Принципы диагностики вирусных инфекций
- •3.3. Лабораторная диагностика вирусных гепатитов
- •3.4. Лабораторная диагностика спиДа
- •4. Другие инфекции
- •4.1. Классификация грибов. Методы диагностики микозов
- •Методы диагностики микозов
- •Лабораторная диагностика кандидомикоза
- •Лабораторная диагностика глубоких микозов,
- •4.2. Возбудители мадуромикоза
- •4.3. Возбудитель пневмоцистоза
- •4.4. Возбудитель донованоза
- •4.5. Возбудитель язвы Бурули
- •4.6. Возбудитель мелиоидоза
- •Лабораторная диагностика
1.11. Биологический (экспериментальный) метод исследования
Биологический метод исследования - совокупность способов искусственного воспроизведения клинической картины инфекционных болезней или их синдромов на лабораторных животных. Этот метод преследует также ряд других целей:
Диагностика инфекционных болезней.
2. Выделение и идентификация чистой культуры.
3. Определение вирулентности.
4. Выделение и идентификация экзотоксинов.
5. Культивирование вирусов.
6. Получение иммунопрепаратов.
7. Проверка безвредности и эффективности лечебных препаратов (в т.ч. химиопрепаратов, иммунопрепаратов) и другие.
Этапы метода:
1. Забор материала (виды материала см. Бактериоскопический метод),
2. Обработка материала.
3. Выбор лабораторного животного, исходя из его чувствительности к предполагаемому возбудителю, его стандартизация и маркировка.
4. Заражение животных одним из способов (подкожный, внутрикожный, внутрибрюшинный, внутримышечный, интрацеребральный, внутривенный, в желудок, интраназальный и др.) в зависимости от тропизма микроба.
5. Регистрация признаков болезни зараженного животного или его смерти.
6. Прижизненный забор материала от животного и проведение бактериологического и серологического исследования, постановка аллергической пробы.
7. Вскрытие, изучение патологоанатомической и патоморфологической картины, протокольный посев органов павших или убитых животных (для выявления обсемененности и выделения чистой культуры). Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов.
8. Идентификация выделенной культуры.
9. Заключение по результатам исследования.
Оценка метода:
Метод высокочувствителен, может быть использован на ранних этапах
болезни, но не всегда доступен, дорог, длителен, небезопасен.
1.12. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам применяют три метода: диффузии препарата в агар из бумажных дисков, серийных разведении в бульоне и в плотной питательной среде. Имеются также ускоренные методы.
8 качестве критерия чувствительности микробов к антибиотикам избирают их терапевтические концентрации в крови и других биотопах животного организма после введения определенных доз препарата. Мерой чувствительности микробов является минимальная концентрация препарата(мкг/ед/мл), которая подавляет рост микробов на питательных средах в стандартных условиях постановки опыта (минимальная подавляющая концентрация - МПК).
Метод бумажных дисков. Для его проведения нужны стандартные заводские диски, пропитанные антибиотиками в определенной концентрации, и стандартная питательная среда. Из суточной микробной культуры готовят взвесь на физрастворе (густота 1 млрд микробных тел в 1 мл), которую затем разводят в 10 раз. На поверхность плотной среды наливают 1 -2 мл указанной культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности среды. Остаток удаляют пипеткой. Среду подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски (не более 6 на чашку) на расстоянии 2 см друг от друга и от краев чашки. Инкубируют в термостате при 37°С - 24 часа.
Учет: в падающем свете на фоне темной поверхности измеряют диаметр (с учетом диаметра диска) задержки роста. Оценку результатов проводят по специальной таблице путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны в таблице. Культуру относят к одной из трех категорий:
чувствительная, умеренно-чувствительная и устойчивая. Указанные категории предложены клинической химиотерапией, исходя из отношения между МПК и концентрацией препарата в крови при введении терапевтических доз. К чувствительным относят культуры, рост которых подавляется концентрациями препарата, создаваемыми в сыворотке крови больного в процессе назначения обычных доз антибиотика. Умеренно-устойчивыми считаются культуры, подавляемые концентрациями, которые могут быть достигнуты при введении максимальных доз препарата. Устойчивые - культуры, рост которых не подавляется при введении даже максимально допустимых доз препарата.
Указанный метод является полуколичественным. Для получения количественных результатов используют методы серийных разведении.
Метод серийного разведения антибиотика в бульоне. Готовят ряд убывающих разведении антибиотика в пробирках с бульоном (кратные 2) и добавляют испытуемую культуру. Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотика. Через сутки инкубации в термостате определяют МПК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста. Для определения бактерицидного действия из нескольких пробирок с задержкой роста делают высев петлей на сектора чашки Петри с МПА. За бактерицидную концентрацию принимают концентрацию препарата в последней пробирке, высев из которой не дал роста.
Метод серийных разведении в плотной питательной среде. Этот метод более чувствителен и точен. Каждый антибиотик испытывают в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в три чашки Петри (по одной чашке на каждую концентрацию). Контролем служит чашка с агаром без антибиотика. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотика 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста о термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет ни одной колонии. Микроорганизмы, рост которых подавлен всеми 3 концентрациями, рассматривают как чувствительные (в этом случае можно применять антибиотик в терапевтической дозе); 2-й и 3-й концентрациями как среднечувствительные (антибиотик можно применять только в увеличенной дозе); 3-й как умеренно-устойчивые микроорганизмы (антибиотик можно применять только местно); растущие на всех трех концентрациях относят к устойчивым (антибиотик нельзя применять).
Схема определения чувствительности культуры к пенициллину.
Антибиотик |
Концентрация, ед\мл |
Контроль |
МПК, ед\мл |
Оценка чувствительности культуры | ||||
0,25 |
16 |
128 | ||||||
Пенициллин |
- |
- |
- |
+ |
<0,25 |
Чувствительная | ||
+ |
- |
- |
+ |
16 |
Средне чувствительная | |||
+ |
+ |
- |
+ |
128 |
Умеренно устойчивая | |||
+ |
+ |
+ |
+ |
>128 |
устойчивая |
Ускоренные методы. Позволяют получить результат через 3-4 часа. Чаще всего пользуются методом, основанным на изменении окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) среды в процессе роста микроба в присутствии антибиотика.
Ход работы: при использовании метода бумажных дисков или серийных разведении антибиотика в агаре через 4-6 часов роста культуры поверхность чашки обрабатывают индикатором, реагирующим на ОВП среды (тетразолий хлорид). В местах роста микроба среда окрашивается в красный цвет, при отсутствии роста микроба цвет среды не меняется. Учет и критерии оценки, как и при обычных методах.
В последние годы разработана специальная тест-система ускоренного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (посев тест-микроба в жидкую среду с антибиотиком, инкубация 4-6 часов с последующим определением прироста мутности раствора опытных образцов в сравнении с контрольными).