3.4. Лабораторная диагностика спиДа

При диагностике ВИЧ-инфекции необходимо:

1. Определение наличия вируса или его антигенов в материале от больного (вирусологическими методами или ИФА).

2. Серологическая диагностика. Выявление специфических антител к поверхностным (gp.120;gp.41) и внутренним (р.24;р.17) антигенам ВИЧ.

3. Выявление патогномоничных (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе.

4. Определение возбудителей СПИД-ассоциированных заболеваний.

Вирусологическая диагностика. Материал для выделения ВИЧ: Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, лимфотические узлы, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость. Полученным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (Н9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образование симпластов), а также методами иммунофлюоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы исследования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.

Точными и достоверными являются методы гибридизации нуклеиновых кислот. Они основаны на способности одноцепочечных комплементарных нитей нуклеиновых кислот, меченых радиоизотопом или ферментом (зондов), образовывать с вирусспецифическими нуклеиновыми кислотами из исследуемого материала двунитчатые структуры. Эти методы дают возможность идентифицировать одну вирусную частицу в 10 мл. крови, содержащей ВИЧ. Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осуществляют с помощью моноклональных антител. Однако это можно выполнить только в крупных лабораториях.

Серологическая диагностика. В настоящее время получила наибольшее распространение.

Материал для исследования: 5 мл. гепаринизированной крови, которую до доставки в лабораторию можно хранить 6-8 часов в охлажденном, но не в замороженном состоянии.

С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА). Это скрининговый метод. Принцип работы основан на классическом принципе прямого ИФА. Иммуносорбентом являются полистироловые планшеты с иммобилизированным инактивированным вирусспецифическим антигеном, полученным из ВИЧ, либо синтетическим путем. Затем вносят испытуемую сыворотку в разведении. Проводят инкубацию в лунках с антигеном. После связывания АГ с AT следует трехкратное отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к иммуноглобулинам человека с ферментной меткой. Образование специфического комплекса АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате окраска среды меняется пропорционально количеству антител. Результаты исследования учитывают на спектрофотометре. Сыворотки крови, имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо исследовать методом иммунного блотинга.

Иммунный блотинг является подтверждающим тестом. Он основан на предварительном фракционировании по молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим перенесением антигенов на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем на мембрану наносится испытуемая сыворотка. При этом специфические антитела образуют комплекс с конкретным АГ(др.120, др.41, р.24, р.18). Заключительный этап исследования - выявление антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антитела против белков человека, меченые ферментом или радиоизотопной меткой. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела ко всем или большинству антигенов ВИЧ.

Исследования иммунного статуса. Направлены на выявление:

1) уменьшения CD4/CD8 (в N 2 и >, при СПИДе - 0,5 и <);

2) снижения CD4 клеток (<200 клеток/мл.);

3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопению, тромбоцитопению, лимфопению;

4) повышения концентрации Ig А и Ig G в сыворотке крови;

5) снижения реакции бласттрансформации лимфоцитов на митогены; в) отсутствия кожной реакции ГЗТ на несколько антигенов; 7) повышения уровня циркулирующих иммунных комплексов.