Б. Нематричный синтез полинуклеотидов

Если синтез полипептидов сводится к образованию пептидной связи между звеньями, то синтез полинуклеотидов – к образованию фосфоэфирной связи между звеньями. Синтез полинуклеотидов идет по следующей схеме: вначале путем неферментативного химического синтеза получают небольшие блоки – олигонуклеотиды, которые затем «сшивают» с помощью ферментативных реакций; таким образом, здесь используется блочная (конвергентная) стратегия (см. стр. 70). Здесь будет кратко рассмотрена только первая часть схемы – чисто химический синтез олигонуклеотидов.

В качестве мономеров при химическом синтезе олигонуклеотидов используют нуклеозиды (99) и нуклеотиды (5’-нуклеозидфосфаты) (100); формальная схема синтеза следующая:

Как и при синтезе полипептидов, здесь необходимо защитить все «лишние» группы, чтобы протекало только взаимодействие 3’-ОН –группы предыдущего звена и 5’-фосфатной группы последующего. Защищать нужно: А. Группы NH₂ гетероциклических оснований – цитозина, аденина и гуанина; Б. «Лишние» группы ОН (для ДНК – 5’-ОН-группу нуклеозида и 3’-ОН-группу нуклеотида, для РНК в дополнение к ним – еще и 2’-ОН-группы); В. Для более совершенных вариантов – группу Р-О‾; для более простых вариантов эта группа не защищается.

Рассмотрим наиболее простой вариант синтеза олигонуклеотидов – так называемый фосфодиэфирный метод (на примере синтеза дезоксирибоолигонуклеотидов):

При взаимодействии 5’-защищенного нуклеозида (102) и 3’-защищенного нуклеотида (103) образуется защищенный с двух концов динуклеотид (104). Далее снимают защиту с одного из концов динуклеотида (в данном примере удаляют защитуY с 3’-конца); освободившаяся группа (в данном случае 3’-ОН) реагирует со следующим мономером (здесь – 3’-защищенным нуклеотидом) с образованием дизащищенного тринуклеотида (105) и т.д.; к сожалению, «и т.д.» в этом варианте не идет дальше четвертого звена. [группы NH₂ гетероциклических оснований Bⁱ в этом варианте защищены; их защита здесь не рассматривается].

В качестве защитных групп для 5’-ОН-групп наиболее часто используются тритильная (трифенилметильная) группа (Z = Ph₃C) или ее замещенные в бензольных ядрах аналоги; эта защита легко снимается в мягких условиях в кислых средах. В качестве защитной группы для 3’-ОН-группы чаще всего используется ацетильная (Y = CH₃CO); она снимается действием водного раствора аммиака. В качестве конденсирующего агента при образовании фосфоэфирной связи используют уже знакомые по пептидному синтезу карбодиимиды (прежде всего DСС), а также арилсульфохлориды ArSO₂Cl.

Фосфодиэфирный способ предоставляет для синтеза олигонуклеотидов ограниченные возможности по сравнению с фосфотриэфирным, в котором защищена также группа Р-О‾; однако для принципиального понимания стратегии синтеза олигонуклеотидов рассмотрения фосфодиэфирного метода вполне достаточно.

Олигонуклеотиды с малым числом звеньев (например, тримеры), достаточно легко получаемые даже по фосфодиэфирному методу, можно подвергать «обычной» гомополиконденсации, используя эти олигонуклеотиды как мономеры типа а-R-b. Для этого продукт рассмотренного выше синтеза [например, соединение типа (105)] фосфорилируют по 5’-ОН-группе (это сделать нетрудно, т.к. первичная 5’-ОН-группа активнее вторичной 3’-ОН-группы); полученное соединение (106) подвергают поликонденсации с использованием тех же конденсирующих реагентов, что и в программируемом синтезе:

Подобные «гомополимеры» с олигонуклеотидными элементарными звеньями использовались для расшифровки белкового кода; они также могут служить относительно легко доступными моделями для изучения свойств природных полинуклеотидов.

Далее коротко рассмотрим матричную поликонденсацию.