[Rukavishnikov_A.I.]_Azbuka_raka(BookFi.org)

- моноклональными антителами блокировать рецептор VEGFR-1, что предотвратит миграцию гемопоэтических клеток костного мозга для формиро-

вания преметастазных ниш и миграцию раковых клеток в их места;

- введение моноклональных антител против VEGFR-2, что предотвратит миграцию эндотелиальных клеток стромы костного мозга в места формирова-

ния преметастазных ниш, а значит, не будет ангиогенеза в них, и остановится формирование ниш.

- предотвратить секрецию в нише гемопоэтическими клетками костного мозга вязкого фибронектина, что будет мешать раковой клетке «встраиваться» в ткань органа-мишени.

«Так в корне может измениться лечение рака – пока оно направлено на уничтожение раковых клеток в организме. Но теперь расширяются возможно-

сти определять степень риска образования метастазов у каждого пациента и проводить профилактическое лечение», – говорит проф. Д. Лайден.

Исследования были выполнены только на мышах, но учѐные считают, что подобные молекулярные причины существуют у людей. Они планируют начать клинические испытания на людях в течение следующего года.

Открытие проф. Д. Лайдена и его группы, а также других учѐных сущест-

венно дополняют молекулярные причины процесса метастазирования раковых клеток.

Это открыло белки-сигналы и белки-рецепторы метастазирования рако-

вых клеток, и возможность предсказания «угрозы образования» метастазов, их ранней диагностики и избирательного уничтожения.

Однако, что заставляет раковые клетки мигрировать в окружающие ткани и метастазировать, – ответов нет. Теперь, когда мы знаем, что раковая клетка, –

это стволовая клетка, можно дать и ответ: причиной инвазии и метастазирова-

ния является хоуминг раковой стволовой клетки – миграция еѐ в «нужное ме-

сто», в свою стволовую нишу.

Стволовые клетки имеют естественную способность создавать себе

«дом», т.е. нишу, чтобы находиться в благоприятной среде и самообновляться.

170

«Нам всем нужен дом, и стволовые клетки с их сильным инстинктом к выжива-

нию являются активными строителями жилья», – сказала проф. Руохола-Бейкер

(2006) из США.

171

Глава 7. Методы для ранней диагностики раковых клеток

7.1. ПЦР-ММК – метод ранней диагностики раковых клеток

Из первой раковой клетки за счѐт еѐ деления вначале в ткани образуется узелок в 1-2 мм в диаметре. Но уже с этого размера раковые клетки индуциру-

ют внутри узелка ангиогенез и лимфангиогенез. С началом оттока крови и лимфы из узелка раковые клетки отделяются от него и с кровью и лимфой раз-

носятся по организму пациента – рак становится болезнью всего организма па-

циента.

Из этого следует, что диагностика рака, любого размера, видимого глазом и с помощью приборов – это поздняя диагностика. Пока в практике врача-

онколога диагностика рака тогда, когда рак проявляет себя симптомами.

Учѐные разных стран и нашей страны разными методами стремятся пе-

рейти к диагностике рака задолго до его симптомов. Именно на таком этапе бо-

лезни, можно надеяться на излечение от рака.

Нормальная клетка превращается в раковую после воздействия на неѐ ка-

кого-либо канцерогена. Это вызывает в ней изменения экспрессии генов, соз-

дающих ее свойства. Вторая причина – изменения экспрессии генов-

супрессоров в этой клетке метилированием их промотора, а также мутации. Эти изменения происходят в генах, регулирующих процесс деления клетки, в генах,

ингибирующих деление клетки при нарушениях в еѐ геноме, а также в генах,

вызывающих апоптоз в таких клетках.

Каждый дефект в геноме раковой клетки является маркером такой клетки.

Термин маркер (от англ. mark – метка). Диагностика первой раковой клетки и еѐ близких потомков по генам-маркерам – это ранняя диагностика рака у паци-

ента.

Но как найти в организме пациента раковую клетку и еѐ потомки от пер-

вых делений среди 5 1013-14 клеток организма взрослого человека.

Как и любая клетка, раковая клетка микроскопического размера, возник-

нув в ткани, ничем не беспокоит пациента. За счѐт свойства к инвазии еѐ по-

172

томки распространяются в окружающие здоровые ткани и по всему организму,

где, оседая, дают новые очаги рака – метастазы.

Задача диагностики разрозненных раковых клеток в тканях различных органов сопоставима даже не с поиском иголки в стоге сена, а с поиском кон-

кретного пучка сена в этом стоге. Поэтому не нужно быть слишком большим пессимистом, чтобы предположить всю «тупиковость» такой ситуации в прак-

тике врача-онколога.

Но все изменил метод ПЦР, т.е. полимеразная цепная реакция, а в сочета-

нии с ММК – методом молекулярных колоний, разработанным нашими учѐны-

ми – чл.-корр. А.Б. Четвериным и Е.В. Четвериной (2002), стал для ранней ди-

агностики весьма точным.

При любой локализации рака в кровь пациента попадают: а) сами рако-

вые клетки – из стенок мозаичных капилляров узелка из раковых клеток в 1-2

мм в диаметре и б) гены-маркеры из погибших раковых клеток еще задолго до проявления как первичного очага рака, так и его метастазов. Это и позволяет выявлять рак у пациента с самого начала, т.е. с размера узелка в 1-2 мм в диа-

метре.

Ещѐ в 60-70-х гг. XX в. Ф. Анкер (Ph. Anker) из Швейцарии сделал пер-

вые попытки доказать возможность обнаружения дефектных генов из раковых клеток в крови от пациента.

Наш учѐный, проф. А.С. Белохвостов еще в 1960 г. XX в. обнаружил де-

фектные гены из раковых клеток яичника и желудка в асцитной жидкости. Он же с коллегами в 1978 г. XX в. доказал выход дефектных генов из раковых кле-

ток в кровоток из опухолей в эксперименте на животных.

Теперь дефектные гены из раковых клеток обнаруживают с помощью ПЦР, а также ПЦР-ММК не только в крови, но и в других выделениях от паци-

ента – слюна, слѐзная жидкость, слизь, мокрота, моча и др., в зависимости от типа раковой клетки.

Раковые клетки разрушаются в тканях за счѐт апоптоза как клетки с де-

фектами в геноме, а также при уничтожении Т-клетками. ДНК из них попадает

173

в межклеточную жидкость, а из неѐ в кровь. В кровь попадают раковые клетки из первичного очага рака и метастазов. В крови они разрушаются, в том числе Т-клетками.

Молекулы ДНК и иРНК не могут быть вне клетки, в частности, раковой клетки, а раковая клетка не может быть без ДНК и иРНК. Поэтому выявление этих молекул является эквивалентом обнаружения их носителя – раковой клет-

ки.

Точно также по молекулам ДНК, РНК диагностируют бактерии и вирусы

– возбудителей различных инфекций у пациентов.

Выявление генов-маркеров раковых клеток в их ДНК является идеальным методом для ранней диагностики раковых клеток, контроля лечения и излече-

ния, а также предсказания и диагностики рецидива и метастаза рака у пациен-

тов.

ПЦР-диагностика раковых клеток по плазме крови Процесс, благодаря которому можно получать копии генов из ДНК в не-

ограниченном количестве, называют полимеразной цепной реакцией – ПЦР.

ПЦР открыл в 1983 г. американский ученый К. Мюллис (Kary B. Mullis),

за что он был удостоен Нобелевской премии.

Мишенями ПЦР являются – фрагмент ДНК с находящимся в нѐм геном и иРНК – копия гена.

Цель ПЦР – размножить фрагмент ДНК из образца плазмы крови пациен-

та, т.е. получить его копии, а также размножить иРНК до уровня, детектиру-

емого стандартными методами. Чтобы размножить иРНК, еѐ сначала нужно с помощью обратной транскриптазы перевести в комплементарную ей ДНК, т.е.

кДНК.

Таким методом можно обнаружить экспрессию гена или генов по уровню их мРНК, а также мутации в гене, что явилось причиной превращения нор-

мальной клетки в раковую.

Принцип ПЦР

174

Для ПЦР-метода из клинического образца – плазмы крови выделяют смесь всех содержащихся там ДНК и РНК. Далее, чтобы понять принцип копи-

рования этих молекул, нам не обойтись без некоторых знаний об их природе.

Молекула ДНК состоит из двух цепей, построенных из нуклеотидов, ос-

новной частью которых являются азотистые основания: аденин – А, цитозин – Ц, гуанин – Г и тимин – Т. Азотистые основания несут в себе генетическую ин-

формацию о структуре белков, а через них – строение клетки и еѐ функции, а

также еѐ воспроизведение, т.е. деление на две дочерние клетки.

В английском языке есть слово ―complement‖ – дополнять, дополнение.

От него в молекулярной биологии появился термин – комплементарность.

Смысл его в том, что молекулы узнают друг друга участками, которые допол-

няют друг друга как «ключ и замок».

По этому принципу цепи нуклеотидов составляют комплементарную па-

ру: А одной цепи всегда против Т другой цепи, а Г против Ц. Когда А и Т в двух цепях ДНК расположены друг против друга, между ними образуются две водородные связи. То же происходит с Г и Ц, но между ними возникает три во-

дородные связи.

Из комплементарности пар оснований следует, что последовательность или порядок размещения азотистых оснований на одной цепи ДНК, определяет порядок азотистых оснований в еѐ другой цепи. Концы цепей ДНК химически различны: у каждой цепи есть 3’-конец и 5’- конец (Рис. 1, 2, 3).

Рис 1. Фрагмент молекулы ДНК.

Цепь ДНК, которая служит матрицей для синтеза матричной РНК на-

зывается матричной цепью.

175

Рис. 2. Цепь мРНК – это копия матричной цепи ДНК, последовательность азотистых оснований в ней та же, что и в нематричной цепи ДНК, но с заменой Т на У.

Цепь мРНК с помощью ПЦР размножают, но сначала еѐ с помощью об-

ратной транскриптазы переводят в комплементарную ей матричную цепь ДНК

– кДНК.

Рис. 3. кДНК синтезирована на матрице мРНК – копии гена.

Образование водородных связей между парами оснований: А-Т и Г-Ц – это спонтанный процесс, т.е. без участия фермента. Эти связи слабые и легко рвутся при нагревании – цепи ДНК отделяются друг от друга, а при охлажде-

нии раствора – вновь спариваются в прежнее комплементарное состояние.

Спонтанный процесс образования пар оснований А-Т и Г-Ц называют гибриди-

зацией.

В основе ПЦР-анализа и лежит гибридизация пар оснований, как спон-

танный процесс.

Выделенные из образца плазмы крови ДНК и иРНК являются мишенями для ПЦР. Их смешивают с реакционным буфером и другими компонентами ПЦР в специальную пробирку и помещают в прибор – ДНК-амплификатор,

дающий циклические изменения температуры реакции.

Цикл ПЦР для размножения молекул-мишеней – ДНК и иРНК состоит из трѐх стадий:

1) расплавление двухцепочечной ДНК путем повышения температуры ре-

акционной среды до 90° С; 2) зная порядок оснований на концах фрагмента ДНК, взятого для раз-

множения, т.е. амплификации, синтезируют химическим путѐм олигонуклеоти-

ды, комплементарные этим участкам – это праймеры;

176

3) присоединение праймеров к матрицам, т.е. к однотяжевым цепям ДНК,

полученными в результате первой стадии. Температура реакционной среды –

50-60°С.

На этой стадии происходит удлинение, т.е. элонгация гибридизованных праймеров ДНК-полимеразой при температуре для работы фермента 70-75°С,

что превращает каждую из цепей в двухцепочечную молекулу ДНК (Рис. 4).

Рис. 4. Схема ПЦР [рис. и цит. по: А.С. Белохвостов (1995) с изменения-

ми]. На схеме цикл удвоения молекулы ДНК из исследуемого образца:

а – цепи исходной молекулы ДНК изображены двумя прямыми линиями;

б – после разделения цепей ДНК, к их концам присоединены по одному комплементарному праймеру в виде прямоугольника;

в – идѐт синтез новых цепочек ДНК.

177

Примечание. Стрелками показано направление синтеза новых цепей в

ПЦР.

По окончании одного первого цикла из одной молекулы двухцепочечной ДНК получены две, в следующем цикле каждая из двух молекул снова удваива-

ется и так далее, с нарастанием числа молекул (N) по формуле: N = 2n, где n –

число циклов. Отсюда и название реакции – цепная.

Теоретически ПЦР позволяет размножить до легко детектируемых коли-

честв даже единственною молекулу-мишень ДНК, даже если она находится среди множества других молекул ДНК и РНК. Стандартная ПЦР постоянно со-

вершенствуется.

Продукты ПЦР – молекулы ДНК, а значит гены и иРНК подвергаются анализу рядом методов, например электрофорезом в геле с окраской молекулы ДНК бромидом этидия и др. Определяются ген(-ы) и мутации в них: замена – пара оснований меняется на другую; вставка – в молекулу введена новая пара оснований; делеция – отсутствие пары комплементарных оснований в гене. По количеству копий иРНК гена судят о степени его экспрессии в клетке.

Различают два варианта ПЦР-диагностики: 1) качественный тест и 2) ко-

личественный тест.

Для качественного теста требуется лишь дать ответ: «да» или «нет», т.е.

содержится ли в образце ДНК или иРНК. Для диагностики вирусной инфекции обычно достаточен факт обнаружения в образце вирусной ДНК или иРНК.

Для обнаружения раковой клетки в образце недостаточно, например, об-

наружить иРНК, так как она может быть продуктом и нормальной, и раковой клетки.

Количественный тест определяет титр, т.е. число копий молекул-

мишеней в определенном количестве образца, здесь крайне важны мишени – ДНК и иРНК.

Ведь для ранней диагностики рака крайне важно обнаружить его на са-

мом раннем этапе – на уровне первой раковой клетки и еѐ первых потомков, а

еще лучше на уровне предраковой клетки по генетическим маркерам в молеку-

178

лах-мишенях – ДНК и иРНК. На уровне одной из этих клеток титр мишени бу-

дет минимальным.

Титр мишеней – ДНК и иРНК и их генетические маркеры необходимы:

1)для исследования молекулярных причин превращения нормальной клетки в раковую клетку в конкретном случае;

2)для слежения за течением скрытого ещѐ рака на уровне первой раковой клетки и еѐ первых потомков, но также и для рака с симптомами;

3)для оценки эффективности лечения рака, коррекции лечения рака в процессе его лечения по состоянию генетических маркеров раковых клеток.

Чувствительность стандартной ПЦР разные авторы оценивают по-

разному; причиной этого может быть и степень чувствительности еѐ в специфи-

ческом обнаружении молекул-мишеней, но и характер клинического образца – плазма крови, ткань опухоли, слюна, моча и другие различные выделения.

ПЦР-ММК-метод для ранней диагностики раковой клетки или клеток по плазме крови

Стандартная ПЦР может давать сбои и ошибки, в результате чего: 1) мо-

лекулы-мишени не будут выявлены из-за потери их в процессе подготовки об-

разца; 2) молекулы-мишени могут быть не размножены в процессе ПЦР, тем бо-

лее что в обычной клинической практике молекулы-мишени представляют не-

значительную долю среди ненужных матриц в образце.

Чл.-корр. А.Б. Четверин и Е.В. Четверина – сотрудники Института белка РАН – открыли метод молекулярных колоний – ММК, для прямого определе-

ния титра молекулы-мишени и пространственное разделение размножения нужных молекул-мишеней от ненужных. Этот метод запатентован учѐными в РФ и в США (1995, 1998).

Принцип метода в том, что молекулы-мишени – ДНК и иРНК – размно-

жаются не в жидкости, а в геле. Это создает отдельные колонии, каждая из ко-

торых является потомством единственной молекулы, т.е. клон.

179