[Rukavishnikov_A.I.]_Azbuka_raka(BookFi.org)

Глава 8. Методы уничтожения раковых клеток

8.1. «Малые интерферирующие РНК» – «выключатели» гена и сред-

ство для ингибирования пролиферации раковых клеток

В клетке каждого типа организма одинаковый набор генов. Но только часть из них работает. Причем в одном типе – одни, а в другом типе клетки – другие гены. Мы ещѐ не знаем, какие гены в клетке разного типа включены, а

какие нет.

Включение или экспрессия гена – это синтез копии его кодирующей це-

почки – иРНК, а по ней как на матрице синтез белка в рибосоме клетки.

Этот процесс происходит в клетке так:

-две цепи ДНК в нужном месте разделяются, открывая ген, т.е. участок кодирующей цепи;

-к нуклеотидам его по принципу комплементарности оснований присое-

диняются нуклеотиды, образуя одноцепочечную информационную РНК

(иРНК). В ней, в отличие от ДНК, основание Т (тимин) заменяется основанием

– У (урацил).

Этот процесс переноса информации с гена на РНК с образованием иРНК называется транскрипцией гена. По такому принципу на разных генах в клетке образуется также транспортная (тРНК) и рибосомная РНК (риб-РНК).

иРНК несет в себе всю информацию гена, кроме той, что в интронах гена,

– она удаляется при созревании иРНК. иРНК передает информацию на риб-

РНК в рибосоме клетки. тРНК доставляет к рибосоме части для белков – ами-

нокислоты в соответствии с той инструкцией, что в иРНК. Так на рибосоме строится полипептидная цепь, но обычно цепи, образующие молекулы белков.

Понимание молекулярных причин «включения» и «выключения» генов позволит управлять этим процессом и держать его под контролем, чтобы, на-

пример, предупредить возникновение из нормальной клетки раковой клетки.

В клетке гены, кодирующие белки, составляют 2%, а вне-генная, т.е. не кодирующая белки остальная часть ДНК, составляет 98% генома клетки. По-

210

этому ее назвали – «junk» ДНК, что означает «хлам, утиль». Но «не кодирует» –

не значит, что «не используется».

Оказалось, что во «вне-генной» части имеется множество генов, которые

«разбросаны» внутри обычных генов и между генами. Но их продуктом являет-

ся не белок, а «малые» РНК. В класс «малых» молекул РНК включают молеку-

лы, содержащие короткой длины цепочки нуклеотидов.

Отличия «малых» РНК от трѐх клеточных РНК:

-они из двух цепей нуклеотидов, которые спариваются друг с другом по принципу комплементарности, что и в ДНК хромосом;

-по 3 концам каждой из цепочек всегда остаѐтся два неспаренных нук-

леотида.

В клетке «малые» РНК заняты другим делом: регулируют работу обыч-

ных генов. Они включают их экспрессию или выключают их из экспрессии, ко-

гда это нужно в клетке.

История «малых РНК» клетки началась в начале 90-х годов ХХ в. с экс-

периментов учѐных на цветке «петуний», а затем на черве C.elegans. На обоих живых существах учѐные пытались усилить выражение опредѐленного призна-

ка. Для этого они вводили в их клетки копии гена, т.е. иРНК этого признака. Но вместо усиления выражения, т.е. экспрессии гена, происходило его «замолка-

ние». В биологии это обозначают термином – «сайленсинг» от англ. «silencing»

– молчание, немота. Причиной этого явления оказалась малая интерферирую-

щая РНК (siRNA), которую открыли в 1998 г. ученые из США Эндрю Файр

(Andrew Z. Fire) и Крэйг Меллоу (Craig C. Mello). Эти РНК обладают способно-

стью «выключать» гены путем разрушения их иРНК. Эффект «гашения» экс-

прессии гена «малыми РНК» назван РНК-интерференцией, а короткие молеку-

лы, вызывающие его, назвали siРНК (short interfering RNAs, малые интерфери-

рующие РНК). Это самые короткие молекулы, состоящие у млекопитающих всего из 21-23 нуклеотида.

Вначале было непонятно, как siРНК появляется в клетке после введения в

неѐ копии гена. Авторы открытия выяснили, что в клетке есть молекулярный

211

механизм для синтеза этой молекулы и накопления еѐ. Механизм РНК-

интерференции в клетке запускается двухцепочечной РНК (дцРНК) и осущест-

вляется в несколько этапов.

1-й этап. Белок Дайсер нарезает дцРНК на фрагменты, содержащие ко-

роткие в 21 нуклеотид фрагменты РНК. Это уже siРНК.

2-й этап. Такие фрагменты захватывается комплексом белков – RISC (RNA induced silencing complex).

3-й этап. В комплексе дуплекс коротких РНК расплетается, и только одна цепь siРНК остаѐтся в нѐм. Это фрагмент антисмысловой цепочки гена.

4-й этап. Комплекс RISC с помощью антисмысловой цепи siРНК скани-

рует молекулы РНК клетки. siРНК-наводчик находит комплементарную ей по-

следовательность нуклеотидов в соответствующей смысловой иРНК, т.е. копии гена и разрезает еѐ. Теперь в клетке уже нет иРНК, а, значит, нет и синтеза бел-

ка гена.

Ни один из блокаторов гена, известных до сих пор, не обладает такой специфичностью к своему гену-мишени. Основная функция siРНК – защита ге-

нома клетки. Эти молекулы предохраняют геном от мутаций, генов извне – от вирусов, а также от транспозонов.

Итак, учѐные доказали, что siРНК в клетке блокирует тот ген, матричная цепь которого комплементарна антисмысловой цепи внутри siРНК. Мишенью для молекулы является не сам ген, а его иРНК. То есть ген «выключается» пу-

тѐм разрушения его копии – иРНК, после выхода еѐ из ядра в цитоплазму клет-

ки. Каждая siРНК распознает и разрушает только свою специфическую иРНК и не вызывает никаких побочных эффектов. Замена даже одного нуклеотида внутри siРНК резко снижает эффект интерференции.

Открытие siРНК в 2002 г. признано важнейшим открытием года в списке десяти открытий. Введение в клетку siРНК – это новый метод «выключения» гена (Рис. 1).

212

Раскрытие генома человека в 2000 г. – это открытие нуклеотидной карты ДНК человека. Однако, эта карта описывает только последовательность нук-

леотидов в каждом гене, но не функции гена. Чл.-корр. Л. Киселѐв (2006) счи-

тает, что теперь стало возможным перейти к созданию карты функций генов.

Эта работа, по мнению Л. Киселева, может быть закончена уже через один-два года.

Метод «выключения» гена очень необходим не только для выяснения функций каждого гена в клетке, но и для «выключения» гена-причины, вызы-

вающего ту или иную болезнь, в том числе возникновение раковой клетки из нормальной клетки ткани. Выяснив гены-причины раковой клетки, можно «за-

глушить» гены, – значит, предупредить и возникновение рака.

Для выявления функций гена необходимо иметь клетки в культуре, и, ис-

пользуя метод Файера и Меллоу, можно по очереди выключать ген за геном и смотреть, какие функции клетки при этом пропадают или появляются. Так лю-

ди будут впервые знать, какую функцию или функции выполняет каждый ген в клетке (Л. Киселѐв, 2006).

За открытие «РНК-интерференци» – подавления генов двухцепочечной РНК, американским учѐным Эндрю Файер и Крейг Меллоу присуждена Нобе-

левская премия в области медицины и физиологии за 2006 г.

Успех применения препарата siРНК зависит от доставки его в клетки-

мишени и защиты его от воздействия ферментов клетки. siРНК должны нахо-

диться в клетке достаточно долго, чтобы выполнить свою роль – найти специ-

фические иРНК и связаться с ними. Препарат представляет собой синтезиро-

ванные in vitro двухцепочечные РНК длиной в 21 нуклеотидную пару. Чтобы молекула-препарат легче проникала в клетку и не разрушалась, к молекуле присоединяют липофильную группу (Г. Стикс, 2005). Предполагается, что со временем короткие двухцепочечные РНК можно будет вводить в кровоток па-

циента и лечить системные болезни. Рак с размера узелка 2 мм в диаметре тоже становится системной болезнью.

214

Джон Марганоре (J.M. Marfganore, 2006) из США пишет, что у животного единичная доза siРНК сохраняет активность в организме в течение 22 суток. «Если то, что проделано с клетками млекопитающих в культуре, удастся повто-

рить на уровне целого организма, мы получим уникальный метод создания ле-

карственных препаратов. Осуществится заветная мечта, можно будет прицель-

но выводить из строя нужные гены».

С открытием «РНК-интерференции» появилась возможность подавлять избыточный или недостаточный синтез определѐнных белков в нормальной клетке, что может превратить еѐ в раковую клетку. Учѐные предполагают, что этот метод должен быть лишен побочных эффектов, которыми сопровождаются другие методы лечения рака. Однако надо прежде провести соответствующие исследования на животных, а затем и на пациентах.

8.2. Апоптоз и пути его применения для уничтожения раковых кле-

ток

Это необычное явление впервые заметил древний врач К. Гален (131-203

гг. н.э.). Он наблюдал листопад с деревьев осенью: листья опадают с живой ветки, а если еѐ сломать, то листопад прекратится.

Из этого К. Гален сделал выводы: 1) листопад – это преднамеренное са-

моубийство; 2) листья убивают сами себя, так как при наличии их зимой, снег сломает ветки. Это явление он обозначил термином апоптоз.

Термин «апоптоз» происходит от греч. apo – отделение, ptosis – опадание.

Для К. Галена осталось неясным, – что это за причина в листьях, ведущая их к самоубийству.

Оказалось, что способность к самоубийству присуща любой клетке, как у растений, так и у животных. То есть в каждой клетке имеется программа на апоптоз. В нормальной клетке эта программа выключена.

215

Для поддержания жизни многоклеточного организма требуется, как заме-

на клеток новыми путѐм деления, так и присутствие смерти уже ненужных кле-

ток – апоптоз их.

Отмирание клеток в многоклеточном организме первыми обнаружили биологи. Так, у эмбриона человека между пальцами рук и ног имеются пере-

понки, есть жабры и хвост. Но они к рождению человека исчезают через апоп-

тоз их клеток.

После открытия апоптоза в течение десятилетий учѐные были заняты описанием морфологии апоптоза клеток и стадиями или этапами этого процес-

са. Позднее была изучена морфология другого типа смерти клетки – некроза.

В. Флемминг (W. Flemming, 1843-1905) в 1895 г. дал подробное морфоло-

гическое описание апоптоза клетки. В такой клетке в первую очередь ядро рас-

падается на отдельные фрагменты, которые затем как бы «рассасываются». Па-

раллельно сама клетка распадается на частицы, в последствии названные

«апоптозными тельцами».

Дж. Керр (J.R. Kerr, 1972) и соавторы отметили, что апоптоз имеет не меньшее значение, чем митоз. Любая живая клетка снабжена программой апоп-

тоза, регулируемой рядом генов.

До 1960-х гг. XX века причина апоптоза оставалась невыясненной. Пред-

полагалось, что такая ликвидация клетки происходит посредством фагоцитоза или каким-то другим, ещѐ неизвестным способом.

В 1963 г. двое британцев – С. Бреннер (S. Brenner) и Дж. Салстон (J. Sulston) и американец Р. Горвиц (R. Horvitz) занялись изучением развития много-

клеточного организма от одной клетки до взрослого организма.

Для этого С. Бреннер впервые предложил удачный объект – червь нема-

тоду (C. elegans). Длина его тела меньше 1 мм, а тело прозрачно, что делает удобным изучение размножения клеток просто под микроскопом. При изуче-

нии развития этого простого многоклеточного организма Дж. Салстон открыл апоптоз.

216

Он заметил, что в процессе развития тканей и органов червя клетки не только делились, но и умирали. Удивляло то, что смерть их не была вызвана какими-либо внешними повреждениями. Ему стало ясно, что смерть клеток – чѐтко отрегулированный процесс при развитии червя.

Дж. Салстон мог точно отметить те клетки, которым суждено погибнуть,

– это и есть регулируемый процесс смерти клетки – апоптоз. Учѐный обнару-

жил, что апоптоз регулируется генами – выявил мутацию одного из генов – nuc-

1, продукт его оказался необходимым для деградации ДНК погибающей клет-

ки.

В1970-е гг. Р. Горвиц поставил задачу – обнаружить эти «внутренние причины» гибели клетки, т.е. апоптоза. Он открыл несколько генов, мутации в которых приводят к нарушению апоптоза в эмбриогенезе червя.

В1986 г. он сделал сообщение о первых двух генах, вызывающих апоп-

тоз: «гены смерти» – ced-3 и ced-4 ( название ―ced‖ – от англ. cell death – смерть клетки). Показал, что наличие этих двух генов необходимо, чтобы произошла смерть клетки.

Позднее Р. Горвиц доказал, что другой ген – ced-9, взаимодействуя с ге-

нами ced-3 и ced-4, предотвращает гибель клетки. То есть ген ced-9 – это «ген жизни». Он обнаружил множество генов, направляющих элиминацию погиб-

шей клетки. Он показал, что в геноме человека присутствует ген, подобный ге-

ну ced-3 нематоды: ген ced-3 кодирует фермент каспазу; ген ced-4 –аналог гена у человека для фактора – Apat-1; аналог гена ced-9, предупреждающего апоп-

тоз, у человека – ген bcl-2.

В 2002 г. этим трѐм учѐным – «за открытие регуляции развития органов и программированной клеточной смерти генами» присуждена Нобелевская пре-

мия.

Апоптоз и некроз клетки – разные типы смерти клеток

217

218

ки» при электрофорезе электрофорезе ДНК ДНК

Апоптоз клеток сопровождает человека на протяжении всей его жизни,

начиная с оплодотворенной яйцеклетки. Из неѐ берут начало все типы клеток,

их более 200 типов, а организм взрослого человека состоит из 5∙1013-14 клеток.

Взаимодействия между разными типами клеток объединяет функции организма в единое целое. Клетка каждого типа является частью той или иной ткани и ор-

ганизма в целом. В организме человека каждый день рождается за счѐт деления более тысячи миллиардов клеток и столько же отмирает через апоптоз, и мы не ощущаем этого.

Причины апоптоза клеток В физиологических условиях для:

- сохранения генетически заданной численности клеток в каждой ткани,

стабилизации границ ткани; - ликвидации клеток, случайно оказавшихся вне своей ткани: каждая

клетка на поверхности имеет рецепторы, с которыми связывается антиапоптоз-

ный белок, специфический для каждой ткани. Эти белки непрерывно посылают клетке сигнал: «живи дальше» (В.П. Скулачѐв, 2001). При выходе же клетки из своей ткани, клетка лишается этого белка, сигнал исчезает, и клетка кончает с собой;

- ликвидации клеток, к которым не поступает сигнал к делению от сосед-

них клеток, например, при отсутствии молекулы фактора роста;

- уничтожения нормальных клеток после 50±10 делений – лимит Хейфли-

ка; из-за предельного укорочения теломер на концах ДНК геном такой клетки включает апоптоз;

В патологических условиях для:

-уничтожения клетки с повреждениями ДНК – эпимутации в генах свойств клетки, чтобы она не превратилась в раковую клетку;

-уничтожения клетки с повреждениями ДНК – раковая клетка, чтобы не дала потомства с такими дефектами ДНК, т.е. рак;

219