Uchebnik

выпадает осадок от оранжевого до красного цвета (аминокислоты ароматические, амины ароматические).

Добавляют 2-3 капли реактива Фелинга (раствор I - 34.66 г меди сульфата растворяют в воде, подкисленной 2-3 каплями кислоты серной разведенной и доводят объем водой до 500 мл. Раствор II – 173 г сегнетовой соли и 50 г натрия гидроксида растворяют в 400 мл воды и после охлаждения доводят объем водой до 500 мл. Реактивом служит смесь равных объемов растворов I и II. 5 мл реактива Фелинга разбавляют 5 мл воды, нагревают до кипения), появляется зеленое или бурое окрашивание (аминокислоты одно- и

двухосновные).

Добавляют по каплям при встряхивании кислоту уксусную концентрированную или трихлоруксусную, наблюдается выпадение осадка, реже мути или хлопьев (белковые вещества, кроме желатина). При дальнейшем добавлении кислоты осадок белка растворяется.

Кислый раствор нагревают до кипения, добавляют 1-2 капли раствора аммония сульфата, белок свертывается.

Биуретовая реакция. Добавляют 1-2 мл раствора натрия гидроксида концентрированного и 1 мл раствора меди сульфата, наблюдается яркое сине-

фиолетовое окрашивание (белки, пептиды, белковые комплексы).

* Биуретовую реакцию дают соединения, содержащие не менее 2-х пептидных связей.

* Реактив Фолина более чувствителен, чем биурет (H2N-CO-NH-CO-NH2) особенно на тирозин и триптофан и используется для количественного определения белков по Лоури при длине волны 500 нм.

Реакция Миллона. Добавляют 1-2 мл азотно-ртутного реактива (растворяют при нагревании 2 г металлической ртути в 3 мл кислоты азотной концентрированной, разбавляют водой до 10 мл), нагревают смесь на кипящей водяной бане, выпадает сначала белый осадок, затем при нагревании -

кирпично-красный (белковые вещества, тирозин, триптофан, п-оксифенил-

аланин). Желатин окрашивания не дает.

Ксантопротеиновая реакция. Добавляют 1 мл кислоты азотной концентрированной, появляется муть или белый осадок, цвет которого при нагревании меняется на ярко-желтый (ароматические аминокислоты,

фенилаланин, тирозин, триптофан):

Добавляют двойной объем концентрированного раствора натрия гидроксида, кипятят 2-3 минуты. Выпадает осадок, который при дальнейшем нагревании растворяется, иногда выделяется аммиак. К горячему раствору добавляют 1 мл 10% раствора свинца ацетата или нитрата. При нагревании образуется сначала белый, затем коричневый или черный осадок

(серосодержащие аминокислоты и белки):

301

Мурексидная проба. Добавляют 1-2 мл концентрированной перекиси водорода и 1-2 мл кислоты хлороводородной, образуется осадок (ксантины,

аминокислоты, алкалоиды).

Реакция Сакагучи. Добавляют 1-2 мл раствора натрия гипохлорита, 1-2 мл натрия гидроксида и 1-2 мл 5% α-нафтола, появляется красное окрашивание

(гуанидиновый фрагмент):

Реакция Адамкевича. Добавляют равные количества кислоты уксусной ледяной и серной концентрированной, нагревают до 40-500С, образуется красно-фиолетовое окрашивание (триптофан).

Реакция Гопкинса и Коуля. Добавляют 2-3 мл кислоты глиоксиловой и 2-3 мл кислоты серной концентрированной, появляется фиолетово-синее окрашивание (триптофан):

Реактив Паули. Добавляют 2-3 мл 5% свежеприготовленного раствора диазобензолсульфокислоты и 2-3 мл 5% раствора натрия карбоната, появляется красное окрашивание (тирозин, гистидин).

Добавляют 9 мл раствора бромтимолового синего, нагревают, замеряют оптическую плотность при 610 нм (различные белки): этот метод используют и для количественного анализа белков.

Белковыми веществами являются некоторые гормоны, бактериальные токсины (яды); важнейшие защитные образования, с помощью которых животный организм борется с инфекцией. Без белков невозможны бесчисленные химические реакции, составляющие материальную основу жизнедеятельности, т.к. все ферменты, стимулирующие эти процессы, также являются белками, но это специфические белки, играющие роль катализаторов химических процессов, протекающих в организме, причем ферменты необычайно резко изменяют (обычно в сторону увеличения) скорость химических превращений в процессе обмена веществ, способствуя не только расщеплению, распаду, но и, наоборот, воссозданию, синтезу более сложных веществ из продуктов распада, причем один и тот же фермент может осуществлять и распад, и синтез одних и тех же веществ (обратимость химических превращений). Ферменты обнаружены у всех живых существ, начиная от самых примитивных микроорганизмов. Все выделенные ферменты

302

являются простыми или сложными белками и необходимы для стимуляции деятельности головного мозга, процессов энергообеспечения клеток, восстановления органов и тканей. Функция каждого из ферментов уникальна, т.к. каждый фермент активизирует только один биохимический процесс. В связи с этим, в организме существует огромное количество энзимов, которые подразделяются на две основные группы: пищеварительные и метаболические. Пищеварительные ферменты выделяются в желудочно-кишечном тракте, разрушают питательные вещества, способствуя их адсорбции в системный кровоток: амилаза расщепляет углеводы, протеазы помогают переваривать белки, липаза расщепляет жиры. Метаболические ферменты катализируют биохимические процессы внутри клеток. Некоторые виды пищевых продуктов содержат ферменты, но они легко разрушаются при нагревании. Протеолитическими ферментами являются пепсин, трипсин, реннин, панкреатин и химотрипсин. Помимо улучшения пищеварения, эти ферменты оказывают противовоспалительное действие. Панкреатин используют при ферментной недостаточности поджелудочной железы, муковисцидозе, нарушениях пищеварения, пищевой аллергии, аутоиммунных заболеваниях, вирусных инфекциях и спортивных травмах.

Онколитическими свойствами обладают пептиды небольшого молекулярного веса, продуценты микроорганизмов, которые, относятся к антибиотикам. Большинство из них отличает наличие необычных аминокислот, не встречающихся в полипептидных цепях белков.

Например, блеомицин - гликопептид, состоящий из 6 аминокислотных остатков, один из которых является треонином.

Протеиновые компоненты ядов змей - цитотоксины, представляют собой пептиды из 60-61 аминокислотных остатков.

Хорошо изучена группа растительных белков противоопухолевого действия - лектинов, способных агглютинировать эритроциты и другие клетки живого организма, например, конканавалин А из бобов и агглютинин из проростков пшеницы.

Белковые вещества получили широкое применение в лечении и профилактике различных болезней: это препараты, приготовленные из белков сыворотки крови животных, из казеина и желатины; инсулин для лечения сахарного диабета; фибриновая пленка для остановки кровотечения; - глобулины, применяемые для профилактики ряда инфекционных заболеваний; сывороточный альбумин - как кровезаменитель и т.д.

Молекулярную массу белков определяют по скорости седиментации в ультрацентрифугах (до 80 000 об/мин), разделение - методом электрофореза, в том числе на полиакриламидном геле, методом гель-электрофореза на пластинах, диск-электрофореза, двумерного электрофореза, ионообменной хроматографией (катиониты, аниониты, амфолиты), на сефадексах, аффинной хроматографии, изоэлектрофокусирования, ВЭЖХ.

Строение белковых молекул устанавливают в 4 стадии:

303

Первичная структура - это специфическая последовательность аминокислот в полипептидной цепи, вторичная - скученность цепи, наличие ВМВС и ММВС, третичная - способ скручивания цепи (спирали) или как изогнута и гидратирована спираль в природном белке, четвертичный - взаимодействия между цепями. Типичной четвертичной структурой белка, является гемоглобин, состоящий из 4-х пептидных цепей, связанных водородными, гидрофобными и ионными связями.

Иммуноглобулины - 4 полипептидные цепи связаны дисульфидными мостиками.

Первичная структура устанавливается методом ступенчатого гидролиза или ферментативной деструкции селективными «протеазами» (время, рН, температура). Особенно важно, при этом, определение концевых групп под

действием 2,4-динитрофторбензола (незащищенные NH2-группы на концах цепей дают продукты взаимодействия:

Метод Эрдмана

Так можно установить последовательность 50 остатков аминокислот.

 Предварительно рекомендуется расщепление на фрагменты с бромцианом (специфичен к метионину!):

пептидные связи с триптофаном легко разрываются N-бромсукцинимидом или ферментативными методами.

 Реакция с дансилхлоридом (диметиламинонафталин-5-сульфохлорид):

304

Концевую аминокислоту определяют и ферментативным методом при 30370С и рН 7-9 по скорости гидролиза с помощью различных карбоксипептидаз.

Вопросы для самоконтроля студентов

1Опишите строение и химические свойства галогенкарбоновых кислот.

2Опишите взаимосвязь строения и биоактивности ароматических

кислот.

3Запишите химические свойства ароматических кислот.

4Что такое незаменимые аминокислоты, какова их роль в синтезе белка?

5Перечислите методы разделения и хроматографического анализа аминокислот.

6Перечислите особые химические свойства аминокислот.

7Дайте определение поятия «белки». Опишите особенности их строения.

8Запишите реакции качественного анализа белков различных структурных групп.

9Для чего используются кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз белков?

10Напишите реакции, использующиеся для встречного синтеза белков.

Примеры установления структур природных карбоновых кислот

Высшие (жировые) и аминокислоты идентифицируют по времени выхода в сравнении со стандартными образцами (СО, РСО, ГСО) методами ГЖХ и ВЭЖХ;

H2N-CH2-CH=CH-COOH – в ИК спектре устанавливают по характеристичным полосам поглощения NH2, С=С (сопряженная с С=О), СООН;

ПМР: s (2H, J 10 м.д., NH2), t (2H, CH2), d (1H, CH=), d (1H, =CH), s (1H, COOH, J 10 м.д.) т.е. 5 типов протонов, эквивалентных нет, поэтому в спектре будет 5 сигналов, указанных выше.

Цис-транс изомерию можно определить по КССВ.

13С-ЯМР: 4 сигнала, соответствующие 4 атомам углерода, наиболее экранированные углеродные атомы в группе -СООН и H2N-CH2-CH=. Цистранс изомерию можно идентифицировать по положению сигналов:

305

ИК полосы: C-Br ( 645 см-1), ароматическое кольцо (700-

1500, 1620, 1640 см-1 - сопряжение), С=О, ОН ( 1740 см-1).

ПМР: 2 сигнала в области 6-8 м.д., соответствуют двум

попарно эквивалентным протонам (Н-2 и Н-6) и (Н-3 и Н-5), поэтому 2d (2H, J – орто (7-10 Гц); один сигнал 12 м.д. синглет (СООН), т.е. всего 3 сигнала. Попарная эквивалентность свидетельствует в пользу пара-расположения заместителей в ароматическом кольце.

ПМР (D2O): 2 триплетных сигнала (H2N-CH2- 2.5-2.6 м.д., СН2СООН – 3.1-3.2 м.д.) интенсивностью в 2 протона и 2 синглетных сигнала в 2 протона (NH2) и один протон (СООН) свидетельствуют о взаимном (β)

расположении 2 функциональных групп. При нагревании β-аланина (СО) NH3 + Н2С=СН-СООН (CO).

Другие виды спектров использовать нет необходимости.

Изомерные структуры однозначно доказываются спектрами ПМР:

1 Один сигнал (5Н) в области 6-8 м.д. (или 3: d(2Ho), d(2Hм), d(1Hп)) –

монозамещение в ароматическом кольце; синглет (2Н) в области 3-4 м.д. (СН2); синглет (1Н) 12 м.д. (СООН).

24 сигнала (1Н) в области 6-8 м.д.; синглет (3Н) в области 2-3 м.д. (СН3), синглет (1Н) 12 м.д. (СООН). 4 сигнала = 4Н в ароматической области = 2 заместителя в кольце.

34 сигнала (1Н, 6-8 м.д.), 2 синглета (3Н и 1Н). Как видно, число сигналов совпадает для 2 и 3, но в области 6-8 м.д. изменяется характер сигналов.

4В области 6-8 м.д. будет 2do (2H) – попарная эквивалентность протонов

–признак пара-изомера.

Всоставе семян маклюры оранжевой фракция нейтральных липидов составила 20%, полярные липиды 8-9%.

Полярные липиды экстрагировали хлороформом. Отделение полярных липидов от нейтральных и фосфолипидов достигается семикратным хроматографированием (ТСХ) из смеси гексан-эфир 7:3. Глико- и фосфолипиды остаются на старте, а нейтральные имеют Rf 0.4-1.0.

Вкислотном гидролизате липидов фосфотидилхолина обнаружены глицерин и холин (ТСХ), что свидетельствует о природе этих липидов.

Методом ГЖХ установлен жирнокислотный состав суммы фосфолипидов,

аТСХ (силикагель) в парах йода показала 6 различных фосфолипидов, в ИКспектрах которых характерными являются полосы 3010-3020 (С=С), 1740 (С=О), 1260 (Р=О), 1080-1090 (Р-О-С).

306

В ПМР-спектре мультиплет 5.5 м.д. подтверждает СНОСОR-группу (наличие жирных кислот во втором положении), СН2ОР (4.5-4.7 м.д.), СН2ОСО

(3.8-4.0 м.д.); N(CH3)3 – синглет в области 3.3-3.5 м.д.; СН2СО и СН2СН прописываются мультиплетом в области 2.0-2.5 м.д.; СН2 – синглет 1.4 м.д. и

СН3 – 0.8 м.д.

Нейтральные липиды имеют d420 – 0.9268, кислотное число 4.7 мг/КОН, число омыления – 186.0, йодное число – 110%, эфирное число - 181.3.

ВОПРОСЫ И ОТВЕТЫ ДЛЯ ЗАКРЕПЛЕНИЯ МАТЕРИАЛА

1Сформулируйте понятие «карбоновые кислоты», опишите классификацию карбоновых кислот.

2Расскажите особенности номенклатур различных природных карбоновых кислот (окси-, галоген-, амино-, сахарных, ароматических).

3Опишите особые свойства карбоксильной группы.

4Перечислите особые свойства:

оксикислот;

аминокислот;

галогенокислот;

ароматических кислот;

двух- и многоосновных кислот;

непредельных кислот;

карбонилсодержащих кислот.

5Опишите сложные эфиры циклические и ациклические (жиры, масла, липиды, воска, лактоны).

6Что такое пептидная связь (пептиды, бетаины, белки)?

7Перечислите основные типы белковых молекул, опишите их классификацию, дайте краткую характеристику каждой группы.

8Опишите основные методы выделения различных кислот.

9Какова биологическая роль карбоновых кислот?

10Раскажите о возможностях основных методов установления структур кислот и их производных.

1.Карбоновыми называют кислоты, в структуре которых, не зависимо от строения и состава радикала, содержится хотя бы одна карбоксильная группа (СООН).

Классификация:

 по числу –СООН групп – основность;  насыщенные и ненасыщенные (степень непредельности);

по величине R (низшие – «С» 10 и высшие – «С» 10);

по строению R (нормальные, разветвленные, ароматические);

по наличию других атомов и/или функциональных групп (Hal, OH, NH2, NO2, CHO, C(R)O) в радикале.

307

бутан-3-оновая кислота (4 атома «С», третий «С=О» - «+ он», одна СООН «+ овая»)

3 Группа -СООН – одновалентная, формально содержит две функциональные группы «С=О» (карбонильную) и «ОН» (гидроксильная) = карбоксильная. Однако типичных свойств С=О и ОН-групп кислоты не проявляют в силу особого электронного строения:

«ОН». Две связи – семиполярные (С-О).

В целом СООН – акцептор электронов от любого R. 4 Особые свойства

оксикислот:

проявляют свойства первичных (вторичных или третичных) спиртов (ОН) и свойства кислот (СООН);

сила взаимного влияния двух функциональных групп зависит от

расстояния между ними (α-, β-, -…);  поскольку две функциональные группы имеют сродство по ОН-группе,

возможны селективные или смешанные реакции (только по «ОН», только по «СООН» или одновременно).

примеры:

аминокислот:

 амфотерность (NH2- свойства оснований; остаток аммиака; СООН –

взаимное влияние зависит от расстояния между ними (α-, β-, -…);

NH2 – неподеленная пара электронов на атоме азота – донорно-

акцепторное взаимодействие; поляризация связей H N – электрофильный обмен протонов.

примеры:

309

галогенокислот:

усиление кислотных свойств за счет (дополнительная поляризация О Н) акцепторных свойств галогенов;

свойства галогенов и кислот.

примеры:

ароматических (одно- и двухосновных) кислот:

карбоксильная группа – акцептор электронов, заместитель II рода (метаориентант реакций электрофильного замещения в кольце);

преобладают селективные реакции.

примеры:

основность кислот:

чем больше СООН-групп, тем выше кислотность;

селективные или одновременные реакции (средние и кислые);

стадийность диссоциации;

взаимное влияние зависит от расстояния между СООН-группами.

310