Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
DOROFEEVA_A готовый диплом.doc
Скачиваний:
49
Добавлен:
23.03.2015
Размер:
656.9 Кб
Скачать

2. Матеріали та методи досліджень

2.1 Матеріали дослідження

Для виконання поставлених завдань використовували кров хворих чоловіків і жінок, які були поділені на ХК та НВК, без анемії з різними ступенями розвитку анемії, які були поділені на дослідні групи:

І – Контроль (n=20)

ІІ – НВК (n=15)

ІІІ – НВКа (n=76)

IV – ХК (n=11)

V – ХКа (n=23)

Порівняльний аналіз проведений з показниками в контрольній групі, яку склали 20 практично здорових осіб. Оцінку вивчених показників давали відповідно до їх змін у крові:

  • МДА у плазмі – (2,03±0,13) нмоль/мл;

  • Активність СОД – (32,721,06) ум.од.;

  • Каталаза – (1149,649,3) мкМ/хвмгНв;

  • АОА – (43,7±1,75) % ;

  • Церулоплазмін – (308,08±8,79) мг/мл;

  • МСМ по білку – (445,6±18,2) мг/л;

  • МСМ210 – (0,22±0,05) у.о;

  • Fe: чоловіки – (19,00±1,67) мкмоль/л;

жінки – (15,51±1,39) мкмоль/л;

  • HT Fe: чоловіки – (35,00±5,00) %;

жінки – (32,50±5,83) %;

  • ЗЗЗС – (74,35±3,25) мкмоль/л;

  • НЗЗЗС – (55,11±5,83) мкмоль/л;

  • SH у сироватці крові – (72,58±4,75) ммоль/л;

  • SS у сироватці крові – (37,11±3,48) ммоль/л;

  • ТДК у сироватці крові – (2,06±0,16);

  • SH у еритроцитах – (79,54±0,76) ммоль/л;

  • SS у еритроцитах – (13,00±0,56) ммоль/л;

  • ТДК у еритроцитах – (6,18±0,25);

  • NOx – (41,65±5,55) мкмоль/л.

Стан системи ПОЛ оцінювали за концентрацією малонового діальдегіду (МДА) в плазмі крові [6]. Стан системи АОЗ оцінювали за активністю СОД та КТ. Активність СОД вимірювали за Сиротою Т.В. [26], К визначали в гемолізаті еритроцитів за Овсянніковим Л.М. [27].

Активність ЦП визначали за модифікованим методом Ревіна [6]. Для характеристики загального стану хворих використовували визначення загальної АОА плазми крові за Спектор Е.Б. зі співавт. [28]. Процеси ендотоксемії оцінювали за вмістом молекул середньої маси за білком (МСМ) [6] та при довжині хвилі 210 нм (МСМ210), за Ніколайчуком В.В. [6, 29].

Визначення концентрації заліза в сироватці крові, загальну залізозв’язуючу здатність сироватки крові, ненасичену залізозв’язуючу здатність сироватки крові, насичення трансферину визначали за допомогою набору реактивів «Філісіт-Діагностика». Показники тіолдисульфідної системи: SH-, -SS- групп, ТДК, визначали у сироватці крові та у еритроцитах за Верьовкіною І.В. [30], рівень метаболітів оксиду азоту проводили за Метельською В.А. [31].

Для статистичного аналізу даних використовували дескриптивну статистику; порівняння середніх значень змінних здійснювали за допомогою параметричних методів (t-критерію Стьюдента) за нормального розподілу даних ознак, що виражені в інтервальній шкалі. Всі розрахунки виконували у програмі Microsoft Excel.

Всі засоби вимірювальної техніки, які використовувались при виконанні роботи, пройшли метрологічну повірку в установленому порядку.

    1. Методи досліджень

В даній роботі ми використовували наступні методи роботи:

  • Метод отримання плазми крові і еритроцитів

  • Методика визначення концентрації МДА

  • Методика визначення активності СОД

  • Методика визначення активності каталази

  • Методика визначення концентрації ЦП

  • Методика визначення загальної АОА

  • Методика визначення вмісту молекул середньої маси

  • Методика визначення концентрації заліза

  • Методика визначення ТДК

  • Методика визначення рівня метаболітів оксиду азота

  • Статистична обробка результатів

      1. Метод отримання плазми крові і еритроцитів

Для стабілізації донорської крові використовують наступні консерванти: глюгицир, цитроглюкофосфат, циглюфад та інші. В окремих випадках, при необхідності приготування препаратів крові та використання їх в перші 3 години і проведення реінфузії, кров стабілізують розчином гепарину (2,5 - 5 тис. ОД на 50 мл. ізотонічного розчину натрію хлориду для забору 200 мл.крові).     Донор лежить або сидить. Йому накладають жгут в ділянці нижньої третини плеча. Обробляють ділянку ліктєвого згину розчином антисептика. Товстою голкою від системи для взяття крові проколюють попередньо простерилізовану пробку флакона з консервантом, сюди ж вводять голку для випускання повітря з флакона. Тоншою голкою цієї ж системи проводять венепункцію і забирають кров у флакон з консервантом до його заповнення. Після зняття жгута виводять голку з вени. Накладають стерильну тиснучу пов'язку на проколоту судину. Кров, що залишилась у системі, виливають у пробірку для подальшого лабораторного дослідження.     Заповнений кров'ю флакон маркують етикеткою у відповідності до групової приналежності і герметично закривають.

Обов'язковою умовою для отримання плазми являється поділ цільної крові на плазму та клітинну масу. Це досягається або шляхом центрифугування, або відстоюванням протягом 3 - 4 днів при температурі + 4 - 6 градусів по Цельсію. 

Після обробки пробок флаконів вогнем та 5% настоєм йоду, голку одноразової системи для отримання плазми, вводять на достатню глибину шару плазми. Другу голку цієї системи проводять в порожній флакон, до якого підключають пристрій для створення вакууму. Плазма вільно поступає у флакон із створеним від'мним тиском. 

Простіше отримати плазму при допомозі зпарених пластикових мішків. Після фракціонування крові, зібраної в мішок, плазму "витискають" з нього при допомозі простого пристрою, і вона вільно переміщається в мішок для плазми. 

      1. Методика визначення концентрації МДА

Принцип методу: При взаємодії МДА із двома молекулами

тіобарбітурової кислоти (ТБК) при температурі 90-100°С, утворюється

пофарбований триметиновий комплекс із максимумом поглинання при 532 їм

(зелений світлофільтр).

Реактиви:

1. Розчин гемолітику: 0,15 М калію хлорид в 1 мм ЕДТА, рн=7,4

2. Трихлоруксусна кислота (ТХУ): 30% розчин

3. Тіобарбітурова кислота (ТБК): 0,75% розчин

4. Натрію хлорид: 0,85%) розчин

5. Антикоагулянт (цитрат натрію: 3,8% розчин)

6.Зваж відмитих еритроцитів: цільну кров збирають у центрифужну

пробірку, куди попередньо вносять 1-1,5 мол антикоагулянту й

центрифугують 10 хв при 1500 про/хв. Надосадову рідину зливають, а

еритроцити двічі відмивають потрійним обсягом 0,85% розчину натрію

хлориду, щораз центрифугуючи при зазначених вище умовах і зливаючи

надосадову рідину.

Хід визначення:

У центрифужну пробірку вносять 0,1 мол суспензії еритроцитів, 1,9 мол. розчину гемолітику й ретельно перемішують; потім доливають 2 мол 30% трихлоруксусної кислоти (ТХУ) і 2мол 0,75% ТБК, знову перемішують.

Пробірку поміщають на киплячу водяну лазню (15 хв). Після охолодження

до кімнатної температури центрифугують (10 хв, 3000 про/хв.).

Центрифугат колориметрирують у кюветі з робочою довжиною 10 мм при зеленому

світлофільтрі (530-540 їм) проти контролю.

Розрахунки концентрації МДА (З) проводять по формулі:

З= D-50 / 1,56 нмоль/мол еритроцитів,

де D - оптична щільність,

50 - розведення,

1,56 - молярний коефіцієнт экстипції МДА.

      1. Методика визначення активності СОД

Принцип методу засновано на здатності конкурувати з нітросинім тетразолієм (НСТ) за супероксидні аніони, що утворюються в результаті аеробної взаємодії відновленої форми НАДН і феназинметасульфата (ФМС). У результаті цієї реакції НСТ відновлюється з утвором гідразинтетразолію. У присутності СОД відсоток відновлення НСТ зменшується.

Прилади: спектрофотометр, термостат, центрифуга.

Реактиви:

1. Фосфатний буфер, 0,15 М, рн 7,8.

2. ТРИС-ЭДТА буфер, рн 8,0.

3. Реагент 1.62 мг ЭДТА, 500 мг НСТ, 92 мг феназинметасульфату розчиняють в 1000 мол фосфатного буфера, рн 7,8.

4. Реагент 11.76,3 мг НАДН розчиняють в 100 мол ТРИС-ЭДТА буфера, рн 8,0.

Проведення аналізу.

У дві пробірки вносять наступні реагенти:

Реагент

Нульова проба, мол

Досліджувана проба, мол

Трис-нтiбуфер,

рн=7,4

0,05

-

Плазма крові

-

0,05

Реагент 1

2,0

2,0

Реагент 11

0,1

0,1

Реакцію проводять при температурі 25 0С. Вимір ведуть у кюветі з довжиною оптичного шляху 1 див на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 540 нм. Після перемішування компонентів проби в кюветі встановлюють початкову екстинкцію. Через 10 хв вимірюють наростання оптичної щільності розчину.

Розрахунки ведуть по формулі/блокування,

де Ео - екстинкція реакційної суміші у відсутності СОД ( нульової проби)

у стані рівноваги,

Епр - екстинкція досліджуваної проби в стані рівноваги.

За одиницю активності ухвалюють 50% гальмування реакції відновлення НСТ, активність ферменту виражають в наст. од. на 1 г білка.

      1. Методика визначення активності каталази

Метод заснований на вимірі кількості перекису водню, розчепленого каталазою. Каталаза каталізує розкладання перекису водню на молекулярний кисень і воду. За хімічною природою каталаза є гемоферментом, тому що до складу простетичної групи цього ферменту входить гем:

О2 + 2Н2О 2Н2О2

Кількісне визначення активності каталази - це визначення “каталазного числа” і “показника активності каталази”. Каталазним числом називається кількість міліграмів Н2О2, що розкладається 1 мікролітром (1мм3) досліджуваної крові. Принцип визначення каталазного числа ґрунтується за наступною реакцією:

2KMnO4 + 5Н2О2 + 4H2SO4 2KHSO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5О2

т.ч. про кількість зруйнованого перекису водню судять по різниці кількостей марганцевокислого калію, витраченного на титрування до і після дії каталази.

Показником каталази називають дріб, у якій чисельником є каталазне число, а знаменник - число мільйонів еритроцитів в одному мм3 досліджуваної крові.

Хід роботи. 1.Вносять піпеткою 0,1 мл досліджуваної крові, попередньо протерши кінчик капіляра від крові.

2. Піпетку промивають шляхом утягування і випускання назад рідини з мірної колби на 100 мл, куди попередньо наливають 10 мл дистильованої води.

3. Доливають мірну колбу водою до мітки і помічають час, коли кров була розведена. Цей розчин називають основним розчином крові (1:1000), що використовують для визначення каталазного числа.

4. У дві конічні колби наливають 7-8 мл дистильованої води і відмірюють у них по 1 мл основного розчину крові.

5. Вміст першої колби (контроль) зараз же кип'ятять протягом двох хвилин для руйнування каталази, обидві колби залишають на 10 хвилин.

6. У кожну колбу вносять по 2 мл розчиниу перекису водню (1%) і залишають на 30 хвилин.

7. Доливають у кожну колбу по 5 мл 10% розчину сірчаної кислоти й відтітровують вміст 0,1 н розчином марганцевокислого калію до появи рожевого кольору.

Каталаза розкладає перекис водню, тому на титрування другої колби піде менше розчину марганцевокислого калію, чим на титрування вмісту першої колби, де каталаза була зруйнована. Цю різницю множать на 1,7 і одержують каталазне число досліджуваної крові. Принцип обчислення заснований на наступному. Грам-еквівалент перекису водню дорівнює 17. Отже, у 1 мл 0,1 н розчину міститься 1,7 мг перекису водню. 1 мл 0,1 н розчину марганцевокислого калію відповідає 1 мл перекису водню. Таким чином, помноживши 1,7 на різницю між кількістю міллілітрів 0,1 н розчину марганцевокислого калію, одержують кількість мл перекису водню, що розкладається в 1 мм3 досліджуваній крові (каталазне число). Показник активності каталази тоді буде дорівнювати каталазному числу поділеному на кількість еритроцитів в 1 мм3 досліджуваної крові.

      1. Методика визначення концентрації ЦП

Метод Равина заснований на тому, що церулоплазмін (ЦП,

КФ 1.16.3.1) окиснює діаміни, з'єднуючись із диметилпарафенілендиаміном,дає рожеве фарбування, інтенсивність якого пропорційна каталітичної активності ЦП.

Реактиви. 1.0, розчин солянокислого диметилпарафенілендиаміну

(ПФД) в ацетатному буфері рн 5,2 готується перед уживанням.

Навішення робиться на аналітичних вагах. Розчин повинен бути безбарвним, темно-сірий колір реактиву не допускається. ПФД повинен бути перекристалізований, реактив гідрофілен і світлочутливий, навіть у перекристалізованому стані тривалому зберіганню не підлягає. (Зберігати в холодильнику в ексикаторі.).

Ацетатний буфер рН 5,2 готується в такий спосіб: 20 мол крижаний оцтової кислоти й 163 г ацетату натрію трьохводного розливають в 1 л дистильованої води. По класичному пропису методики визначення ЦП в

якості інгібітору реакції застосовується 0,1% азид натрію. Через токсичність

і дефіциту цього реактиву можна використовувати 0,25% розчин роданистого

калію.

Хід визначення. У піддослідну пробірку налити 1,0мол свіжоприготовленого розчину ПФД і додати 0,1 мол сироватки. Схований гемоліз, як правило, не заважає визначенню. Інкубація триває 30 хв при З˚С. Кінетика реакції така, що максимальна активність її падає на початкову швидкість (перші 15 хв), так що час інкубації можна міняти емпірично залежно від активності ПФД із відповідним наступним перерахуванням. Реакція інгібується 5 мол 0,25% роданистого калію і приміщенням пробірок у лід. Оптичну щільність вимірюють на ФЕК або спектрофотометрі при довжині хвилі 525 нм проти «сліпого» контрольного досвіду. У контролі, який відбиває фонову диамінооксидазну активність сироватки й повинен бути індивідуальним для кожного хворого, змінюють порядок додатка реактивів, тобто спочатку додають інгібітор, а потім проводять інкубацію. Визначення ЦП у плазмі проводити не можна, тому що утворюється каламуть, яку усунути не вдається. При відсутності чистого ЦП для стандарту можна калібрувати реакцію побічно, за допомогою паралельного визначення в сироватках здоровіших людей змісту міді й ЦП. Знаючи зміст міді в крові, можна розрахувати кількість ЦП, враховуючи, що практично основна маса міді (95%) пов'язана з ЦП і становить 0,32%).

Си (мкг%) X 100x0,95

ЦП у мг% = 1000x0,32

Визначення міді краще проводити з диэтилтиокарбаматом, а калібровану криву для міді будувати по сірчанокислій міді. Помилка визначення ЦП методом Равина менш 3%. Зміст ЦП у практично здоровіших людей у сироватці становить (24-50) мг%.

      1. Методика визначення загальної АОА

Хід виконання. На льоду готується 5% гомогенат головного мозку щура (у дослідах використовували тварин масою 180±15 г) на трис-НСl-буфері, рН 7,4 (500 мг мозку гомогенізували у 9,5 мл буфера), центрифугували 10 хв при 3000 об/хв. Одержаний центрифугат (2 мл) вносили в центрифужні пробірки об’ємом 10 мл. У дослідні проби добавляли 0,1 мл сироватки (плазми) крові, а в контрольні – 0,1 мл буфера. Проби інкубували 60 хв у водяному термостаті при 37˚С, після чого реакцію зупиняли, вносячи в проби по 2 мл охолодженої 10% трихлороцтової кислоти. Проби центрифугували (10 хв при 3000 об/хв) і в одержаному центрифугаті визначали вміст МА. Для цього в хімічні пробірки вносили 3 мл центрифугату, 1 мл 0,8% тіобарбітурової кислоти і ставили в ки-

п’ячу водяну баню на 15 хв. Після охолодження вимірювали оптичну густину контрольних і дослідних проб на спектрофотометрі СФ-46 при 532 нм в 10 мм кварцових кюветах.Загальну антиоксидантну активність (ЗАОА) виражали у відсотках і розраховували за формулою:

ЗАОА (в %) = ((Дк – Д∂) /Дк) * 100

де Дк – оптична густина контрольної проби;

Д∂ – оптична густина дослідної проби

      1. Методика визначення вмісту молекул середньої маси

Принцип методу: базується на депротеїнізації сироватки крові, нейтралізації білкового супернатанту і подальшому визначенні пептидних компонентів за допомогою методу Лоурі.

Реактиви:

  1. 0,6 н HClO4

  2. 3 M K2CO3

Хід визначення:

До 0,5 мл сироватки крові додають 0,5 мл 0,6 н HClO4, і центрифугують15 – 20 хв. при 3000 об/хв. Безбілковий супернатант нейтралізуємо 3 М К2СО3, витримуємо 15 – 20 хв. на холоді для відділення осаду КСlO-4 (в морозилці). Центрифугуємо 15 хв. при 3000 об/хв. і використовуємо надосад для визначення білка за Лоурі і прямої спектрофотометриї. Для визначення білка за Лоурі надосад розводимо в 5 разів і далі проводять вимірювання за методикою. Для прямої спектрометрії, надосад розводять в 5 разів і спектрофотометрують при довжині хвилі 210 нм на СФ-46.

      1. Методика визначення концентрації заліза

Залізо звільняється ззалізозв'язуючих пептидів сироватки крові та відновлюється завдяки діїгуанідину та гідроксил аміну. Натрієва сіль 3-(2-піріділ)-5,6-біс (4-сульфофеніл)-1,2,4-триазину (феррозину) дає з іонами Fe+2комплекс фіолетового кольору. Оптична щільність дослідного розчину пропорційна концентрації заліза в пробі.

Склад реакційного розчину впробі

Феррозин > 1,10 ммоль/л; тіосечовина - 11,90 ммоль/л; гуанідину гідро хлорид -3,75 моль/л; гідроксил амінугідро хлорид >60 ммоль/л; гліцин, НС 1 - 0,2 моль/л.

Приготування робочих розчинів

Розчини готові та придатні до використання після відкупорювання флаконів протягом місяця при зберіганні від+2 до +8°С.

Витримують 5-10 хв. при кімнатній температурі, виміряють оптичну щільність дослідної (Едосл) і калібрувальної (ЕКдл) проб проти холостої. Фотометрування - див. Розділ " Обладнання".

Перемішують, витримують 15-20хв., виміряють оптичну щільність дослідної (Едосл') і калібрувальної (ЕКдл') проб проти холостої з колірореагентом.

 

      1. Методика визначення ТДК

Для визначення співвідношення тиольних та дисульфідних зв`язків у еритроцитах використано колориметричний метод, оснований на реакції взаємодії 5,5/-дитиобис(2-нитробензойной)кислоти з сульфгідрильними та дисульфідними групами [i].

За рН=8,0 5,5/-дитиобіс-(2-нітробензойна)кислота (ДТНБК) взаємодіє з вільними SH-групами білків (стадія 1 рис.2.2). В ході цієї реакції відбувається вивільнення тионітрофенільного аніону (ТНФА). Кількість утвореного ТНФА прямо пропорційна кількості вільних SH-груп білків, що прореагували з ДТНБК.

При рН 10,5 реакція може продовжуватися при умові, що у білках, окрім SH-груп, присутні –S–S– групи (стадії 2 та 3 рис.2.2.9.).

Кількість дисульфідних груп в білках розраховують, порівнюючи вміст вільних ТНФА визначений при рН=8,0 та після доведення рН до 10,5.

Для отримання білкового розчину еритроцитів крові спочатку еритроцити гемолізували витримуючи їх на протязі 25 хвилин при кімнатній температурі після розведення дистильованою водою (1:10). Потім відділяли гемоглобін: у центрифужні пробірки з гемолізатом (по 0,5 мл) послідовно додавали 0,25 мл хлороформу, 0,5 мл 96% етилового спирту, не перемішували і додавали 300 мг солі КН2РО4. Обережно “притоптували” гемоглобін разом з сіллю до дна пробірки, доки не утвориться дві фази: знизу – тіні еритроцитів та гемоглобін, зверху – білковий розчин еритроцитів. Далі проби центрифугували при 2000 об/хв на протязі 20 хвилин та відбирали супернатант, який вносили до пробірок Флоринського по 0,4 мл. Після додавання до нього 1,2 мл фізіологічного розчину отримували так званий розчин білка еритроцитів об`ємом 1,6 мл.

Рис. 2.2.9. Взаємодія ДТНБК з сульфгідрильними та дисульфідними групами

У роботі використовували реактив Елмана (2ммоль/л), який готували наступним чином: 31,72 мг 5,5/-дитиобіс-(2-нітробензойна)кислоти розчиняли у 40 мл 0,01 моль/л фосфатного буфера і доводили рН до 8,1.

Робота по визначенню кількості SH– та –S–S– груп у білковому розчині еритроцитів проводилася за протоколом, що подано у таблиці 2.1.

Таблиця 2.1. Протокол процедури визначення концентрації вільних жирних кислот.

Реактиви

Контроль

Експериментальний зразок

визначення кількості SH–

розчин білку, мл

________

1,6

Фізіологічний розчин, мл

1,6

________

трис-фосфатний буфер рН=8,1, мл

________

0,08

реактив Елмана 2ммоль/л, мл

0,4

0,4

вміст пробірок перемішати та через 2 хвилини почати вимірювання ОD при λ=412нм ( у кюветах l = 5 мм ) у режимі через кожні 5 хвилин доки значення ОD досягне сталого значення.

визначення наявності –S–S–

0,1 н NaOH, мл

(для доведення рН=10,5)

0,48

0,48

0,1 н НСl, мл

(для доведення рН=8,1)

0,90

0,90

вміст пробірок перемішати та виміряти ОD при λ=412нм

( у кюветах l = 5 мм )

Загальний вміст тиольних груп (вільні SН-групи + SН-групи, що утворилися з –S–S– зв'язків) розраховували за формулою:

,

де СМ – концентрація тиольних груп, моль/л

∆OD – приріст оптичної густини за час, достатній для завершення реакції,

 – коефіцієнт молярної екстинкції ТНФА ( =11400),

f – фактор розведення.

Вміст дисульфідних зв’язків розраховуємо за формулою:

СМ (–S–S–)

де СМ (–S–S–)– концентрація дисульфідних груп, моль/л

СМ (ТНФА)1 – концентрація тионітрофенильного аніону, моль/л за рН=10,5

СМ (ТНФА)2 – концентрація тионітрофенильного аніону, моль/л за рН=8,1

Величину тиол/дисульфідного коефіцієнту розраховували за формулою:

де – тиол/дисульфідний коефіцієнт.

      1. Методика визначення рівня метаболытыв оксиду азоту

Принцип методу. Полягає в одночасному відновленні нітратів у нітрити в присутності VCl3 і реакції діазотування утворившимся нітритом сульфаніламіду, з подальшим розвитком рожевого забарвлення, інтенсивність якого визначається спектрофотометрично.

Реактиви:

  1. 0,05% водний розчин N-нафтілетилендіаміна (І частина реактиву Грісса).

  2. 1% розчин сульфаніламіду в 30% оцтовій кислоті (ІІ частина реактиву Грісса).

  3. 1N розчин соляної кислоти.

  4. Ванадій хлорид (ІІІ).

  5. 96% етиловий спирт.

Хід визначення:

Сироватку крові депротеінізують 96% етиловим спиртом в співвідношенні сироватки до спирту 1:2 і центрифугують при 2500 об/хв. протягом 20 хв. Для приготування розчину ванадію хлориду (ІІІ) 400мг ванадію хлориду (ІІІ) розчиняли в 50 мл 1N соляної кислоти з подальшим фільтруванням через паперовий фільтр. Після депротоінізації сироватки до супернатанту додають розчин ванадію хлориду (ІІІ) і реактив Грісса у співвідношенні 1:1:1. Суміш інкубують 30 хв. при 37 °С. Для приготування холостої проби замість І частини реактиву Грісса додають таку ж кількість ІІ частини реактиву Грісса. Оптичну щільність дослідної проби проти холостої вимірюють Спектрофотометрично при 540 нм, товщина кювети 5 мм. Вміст метаболітів азоту розраховується за калібрувальною кривою.

Побудова калібрувальної кривої:

Для побудови калібрувального графіку необхідно приготувати стандартний розчин 1М водного розчину нітриту натрію. Перед використанням стандартний розчин розводять в 1000 разів і готують серію розведень. Лінійность кривої зберігається в діапазоні концентрацій нітрит-іону від 5 до 320 мкМ. До кожної проби стандартного розчину додають по 1 мл реактиву Грісса; до кожної холостої проби додають по 1 мл ІІ частини реактиву Грісса. Оптичну щільність дослідної проби проти холостої вимірюють Спектрофотометрично при 540 нм, товщина кювети 5 мм. За цифрами екстинції стандартних розчинів будують калібрувальний графік.

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]