5. Фізіологія росту та розмноження бактерій.

Визначення поняття "ріст"

Існує кілька визначень поняття "ріст", а саме:

збільшення біомаси клітини. Проте не всяке збільшення біомаси клітини можна розглядати як ріст. Так, у азотобактера збільшення біомаси часто відбувається за рахунок ослизнення культури (виділення слизу);

узгоджене збільшення кількості всіх хімічних компонен­тів, з яких складається клітина;

незворотне збільшення кількості живої речовини, як пра­вило, пов'язане з поділом клітин і збільшенням їх кількості. У багатоклітинних мікроорганізмів збільшуються розміри тіла, а в одноклітинних росте кількість клітин;

координована реплікація всіх структур, органел і компо­нентів мікробної клітини, яка, як правило, закінчується її роз­множенням.

Розмноження бактерій

Найчастіше бактерії розмножуються бінарним поділом, коли з однієї клітини утворюється дві, кожна з яких знову ділиться. Про­цесу поділу завжди передує подвоєння (реплікація) ДНК. Існує два типи поділу: перетяжкою і за допомогою поперечної перегородки.

Поділ перетяжкою (констридія) супроводжується звужен­ням клітини в місці її поділу, і в цьому процесі беруть участь усі шари клітинних оболонок. Інвагінація оболонок з обох боків усереди­ну клітини все більше її звужує і, нарешті, ділить на дві . Поділ перетяжкою характерний для грамнегативних бактерій.

Поділ з утворенням поперечної перегородки притаманний грампозитивним бактеріям . Проте у деяких груп бак­терій спостерігається змі­на способів поділу (тіонові, міко- та артробактерії).

Період від поділу до поділу бактеріальної клі­тини називають клітин­ним циклом (онто­генез бактерій).У 6актерій розрізняють кілька типів вегетативного клі­тинного циклу: мономорфний — утворюється тіль­ки один морфологічний тип клітин (бацили, кишкова паличка); диморфний — виникає два типи клітин (бактерії роду Caulobacter) та поліморфний — утворюється кілька морфо­логічно різних типів клітин (актиноміцети, артробактерії).

У сферичних бактерій може утворюватись не одна, а кілька поперечних перего­родок . Якщо вини­кає одна перегородка, то клі­тина ділиться в одній площи­ні і утворюються мікрококи, диплококи, стрептококи. Дві перегородки розміщуються в двох взаємно перпендикуляр­них площинах, і тоді при поді­лі утворюються тетракоки. При розміщенні перегородок у трьох взаємно перпендику­лярних площинах утворюють­ся скупчення клітин у вигляді сарцин. У процесі поділу попе­речною перегородкою цито­плазматична мембрана разом з клітинною стінкою вростає всередину клітини, інвагінати збли­жуються, з'єднуються, і перегородка розщеплюється.

Бактерії можуть розмножуватись також брунькуванням, яке є різновидом бінарного поділу. Цей спосіб поділу притаман­ний бактеріям родів Hyphomlcrobium, Rhodomicrobium, Nitrobacter, які мають диморфні та поліморфні клітинні цикли.

Бактерії характеризуються високою швидкістю розмно­ження. Наприклад, кишкова паличка ділиться кожні 20-30 хв, тобто за добу з однієї клітини утворюється 472-10¹⁹ клітин (2⁷², 72 покоління). Якщо прийняти, що один мільярд сухих клі­тин мають масу 1 мг, то 472 • 10¹⁹ клітин будуть мати масу 4720 т в умовах, що виключають загибель клітин.

Ріст бактерій у бактеріальній популяції

Популяція — це сукупність бактерій одного виду (чиста культура) або різних видів (змішані культури, асоціації), що роз­виваються в обмеженому просторі (поживне середовище та ін.).

У бактеріальній популяції постійно відбувається ріст бак­терій, розмноження та відмирання клітин. Для спостережень за розвитком бактеріальної популяції визначають:

концентрацію бактерій — кількість клітин в 1 мл клі­тинної суспензії (культуральної рідини);

бактеріальну масу (маса клітин, біомаса, густина бакте­ріальної маси) — кількість міліграмів сухої біомаси в 1 мл клі­тинної суспензії (культуральної рідини).

Під час росту періодичної (статичної) бактеріальної куль­тури (тобто такої культури, яка вирощується в будь-якому сере­довищі без його змін) не може бути кореляції між цими двома показниками. Ці показники необхідно розрізняти.

Експоненційинй ріст

Бактерії розмножуються шляхом бінарного поділу, тому їх кількість збільшується в геометричній прогресії: 2° —> 2¹ —> 2^2_ -> 2³ —>... 2". Логарифмуючи, отримаємо:

lgN =lgN₀ + nlg2,

звідки кількість клітинних поділів буде:

n = (lgN-lgN₀) / lg2.

Кількість клітинних поділів за 1 год (константа швидкос­ті поділу v) визначається за формулою

v = n/t = (lg N-lg N₀) / lg 2(t - t ₀ ).

Час, необхідний для одного циклу поділу (тривалість гене­рації g), визначається за формулою

g = t/n = 1/v.

Ріст бактерій у періодичній культурі

При внесенні у поживне середовище бактерії ростуть до тих пір, поки вміст якого-небудь необхідного компонента не ста­не мінімальним або не вичерпається, після чого ріст припиня­ється. Якщо впродовж усього цього часу в середовище не вноси­ти ніяких поживних речовин і не виводити продукти метаболіз­му, то одержимо так звану періодичну культуру (популяцію клітин в обмеженому життєвому просторі).

Крива, що описує залежність логарифму кількості живих клітин від тривалості культивування, називається кривою росту рис. 3.3). Така крива має S-подібну форму, на ній можна виді­лити кілька фаз росту: початкову (лаг-фазу), експоненційну (лога­рифмічну), стаціонарну та відмирання. У деяких посібниках на кривій росту виділяють не чотири, а шість фаз (див. рис. 3.3): лаг-фазу, експоненційну (логарифмічну), сповільненого росту, ста­ціонарну, відмирання та виживання.

Лаг-фаза. Починається з моменту посіву бактерій у свіже поживне середовище. У цей період клітини адаптуються до даних умов культивування. Тривалість лаг-фази залежить від перед­історії інокуляту та його віку, а також від того, наскільки придат­ним для росту є дане середовище і умови культивування (рН, тем­пература, концентрація розчиненого кисню). Наприклад, якщо джерела вуглецю та енергії в новому середовищі відрізняються від тих, які були в середовищі при одержанні посівного матеріа­лу, то адаптація до нових умов передбачає синтез нових фермен­тів, які раніше були непотрібні і тому не синтезувались. Утворен­ня нових ферментів індукується новим субстратом.

Рис. 3.3. Крива росту бактеріальної популяції. Фази росту:

І — лаг-фаза; // — експоненційна; III — сповільненого росту; IV — стаціонарна; V — відмирання; VI — виживання

Прикладом впливу субстрату на синтез ферментів є диауксія. Це явище послідовного використання двох субстратів, або яви­ще двофазного росту . Із суміші глюкози та сорбітолу бак­терії спочатку споживають глюкозу. Ферменти метаболізму сор­бітолу утворюються тільки після повного вичерпання глюкози.

Кількісні зміни складу бактеріальної клітини під час лаг-фази стосуються змін РНК: її вміст збільшується у 8-12 разів. Це вказує на участь РНК і рибосом у синтезі ферментних білків.

Експоненційна фаза. Ця фаза характеризується максималь­ною швидкістю поділу клітин. У цій фазі процеси росту прохо­дять збалансовано (тобто подвоєння біомаси супроводжується подвоєнням кількості білка, ДНК, РНК та ін.). Можна сказати, що культура в експоненційній фазі складається із "стандарт­них" клітин. Але треба мати на увазі, що і в експоненційній фазі клітини періодичної культури зазнають змін, оскільки постійно змінюється середовище: зменшується концентрація субстра­ту, збільшується густина клітинної суспензії, накопичуються продукти обміну. У зв'язку з тим що в цій фазі швидкість поді­лу відносно постійна, вона найзручніша для визначення швид­кості поділу та швидкості росту. Вплив факторів зовнішнього середовища, складу поживного середовища на ріст мікроорга­нізмів визначають, спостерігаючи за показником біомаси чи кіль­кістю клітин саме під час експоненційного росту.

Фаза сповільненого росту. Настання цієї фази зумовлене якісними змінами поживного середовища (споживання пожив­них речовин, накопичення продуктів метаболізму, дефіцит кис­ню, зміна рН). Клітина реагує на це зміною інтенсивності син­тезу РНК, білка, полісахаридів та інших компонентів.

Стаціонарна фаза. Вона настає тоді, коли кількість клі­тин перестає збільшуватись, тобто характеризується рівновагою між клітинами, що утворюються, та клітинами, що гинуть. У ста­ціонарній фазі спостерігається максимальна біомаса і макси­мальна сумарна кількість клітин. Кількість біомаси в стаціонар­ній фазі називають також виходом або врожаєм. Але в науковій літературі термін "вихід біомаси" або "врожай біомаси" зустрі­чаються рідко. В основному використовуються поняття "рівень біомаси", "концентрація біомаси" чи просто "біомаса".

Фаза відмирання. Характеризується зниженням кількості живих клітин, підвищенням гетерогенності популяції. Іноді клітини лізуються під дією своїх власних ферментів (автоліз). Ця фаза досліджена значно менше, ніж попередні.

Фаза виживання. Характеризується наявністю окремих життєздатних клітин в умовах загибелі більшості клітин популяції. Якщо такі клітини пересіяти в свіже поживне середовище, вони починають активно рости та ділитися . Такі виживані клітини харак­теризуються низькою інтенсивністю процесів метаболізму.

Ріст у безперервній культурі

Метод безперервного культивування полягає в тому, що в посудину (ферментатор, культиватор), в якій вирощуються бак­терії, весь час надходить свіже поживне середовище і одночасно з такою самою швидкістю відводиться культуральна рідина, яка вміщує бактеріальні клітини та продукти метаболізму. За тако­го культивування можна якоюсь мірою наблизитись до ідеаль­ної ситуації, коли клітини тривалий час перебувають у фазі експоненційного росту за постійної концентрації субстрату та інших незмінних умов. Розглянемо безперервне культивування в режи­мі хемостату та турбідостату.

Ріст у хемостаті. У цьому режимі ріст бактерій контролю­ється концентрацією субстрату. Підтримуючи постійну концент­рацію одного з необхідних субстратів (джерело азоту чи вугле­цю) регулюванням швидкості протоку середовища (швидкості надходження поживного середовища), можна стабілізувати ріст культури. Основним показником безперервного культивування є швидкість розбавлення середовища .

Ріст культури в хемостаті контролюється концентрацією субстрату. На такому обмеженні швидкості росту концентраці­єю одного з необхідних субстратів {лімітувальний фактор) ґрун­тується стабільність системи.

Ріст у турбідостаті. Принцип роботи турбідостату ґрунту­ється на регулюванні швидкості протоку середовища густиною (мутністю) популяції. Датчик мутності регулює через керуючу систему надходження поживного середовища. Турбідостатний контроль може ґрунтуватися на інших методах вимірювання біомаси або продуктів, які утворюються в процесі їхнього рос­ту. Наприклад, рН-статний спосіб керування швидкістю про­току, використання оксистату- керування швидкістю про­току за швидкістю споживання кисню.

Принципові відмінності між періодичною та безперервною культурами:

періодичну культуру можна розглядати як замкнуту сис­тему (якоюсь мірою подібну до багатоклітинного організму), яка в своєму розвитку проходить кілька фаз (лаг-фаза, експоненційна та ін.). Умови існування у всіх цих фазах різні. Автоматичне регулювання в періодичній культурі навряд чи можливе;

безперервна культура — це відкрита система, яка намага­ється досягти динамічної рівноваги. Фактор часу певною мірою виключається. Для організмів створюються незмінні умови сере­довища. Легко піддається автоматичному регулюванню.

Синхронні культури

Для вивчення синтезу окремих компонентів клітини в про­цесі її поділу, проведення цитогенетичних і генетичних дослід­жень використовують синхронні культури. Це культури, в яких певний час всі клітини діляться одночасно (синхронно) за рахунок однакової готовності до росту та поділу окремих осо­бин. Синхронізація культури досягається фізичними та хіміко-біологічними методами:

фізичні — температурна дія, диференційне центрифугуван­ня, диференційне фільтрування, чергування світлових і темнових режимів у фотосинтезу вальних бактерій. За диференційного центрифугування або фільтрування можна відділити клі­тини легкої фракції (менших розмірів), які діляться синхронно впродовж кількох перших генерацій. Ці два методи є найбільш м'якими методами синхронізації культур;

хіміко-біологічні — вирощування бактерій на неповноцін­них поживних середовищах з наступним перенесенням їх у повно­цінні середовища, вимушене голодування бактерій.