Розділ 3 результати досліджень

3.1. Загальна характеристика плазмід, що використовувалися в клонуванні.

Першим етапом було переклонування фрагменту гена люциферази із плазміди pGL3-Basic у pGEM-3z. Плазміда pGL3-Basic несе в собі ген люциферази, що має розмір 1742 н.з.(рис 3.1.). За допомогою рестриктази HindIII і XbaI, сайти рестрикції яких фланкують послідовність гену люциферази, можна вирізати цей фрагмент.

Рис. 3.1. Плазміда, що несе ген люциферази, яка використовувалась для отримання екзогенного контролю.

Плазміда pGEM-3z, несе в собі ген стійкості до антибіотику, за допомогою якого можна судити про успішність трансформації проводячи синьо-білий тест з використанням X-Gal (або BCIG від англ. bromo – cloro – indol – galactopyranoside) та IPTG (ізопроніл - β - D - 1 - тіогалактопіранозид), а також має ті ж сайти рестрикції, що і pGL3-Basic для утворення липких кінців для проведення лігування (рис. 3.2.).

Рис. 3.2. Плазміда pGEM-3z

3.2. Літературний пошук референтних генів для плаценти.

Згідно опрацьованій літературі, було обрано найбільш стабільні гени для нормалізації даних при дослідженні експресії в плаценті:

-18S pPHK;

-GAPDH;

-YWHAZ;

-ACTB;

-SDHA [18].

3.3. Підбір праймерів для екзогенного контролю

Згідно до умов підбору праймерів, було підібрано 2 праймери (рис. 3.2.).

Рис. 3.3. Характеристики праймерів, що підібрані для екзогенного контролю.

Для перевірки праймерів на специфічність до нашого продукту, використовувалась програма BLASТ, яка показала, що схожі послідовності не зустрічаються і наші праймери будуть максимально специфічними.

3.4. Підбір праймерів для ендогенного контролю

Згідно до умов підбору, та обраних рефернтних генів, були підібрані такі праймери (табл. 3.1.):

Праймери	Послідовність	Tm	G/C
18S	5'-GCAAGACGGACCAGAGCGAAG-3'	55,7 ºC	61.9 %
	5'-AATAACGCCGCCGCATCG-3`		61.1 %
UBC	5'-CCCGCTGCTCATAAGACTCG-3'	55,0ºC
	5'-TTCCTCGCCTGTTCCGCT-3'
TOP1	5'-CACAAGAAGGAGAAGGACC-3'	50,2ºC
	5'-GGAGGAACAAAATAGCCA-3'
YWHAZ	5'-AAATGTTGTAGGAGCCCGTAGG-3'	54,0ºC
	5'-AGTCTGATAGGATGTGTTGGTTGC-3'

Рис. 3.1. Характеристики праймерів, що підібрані для ендогенного контролю.

3.5. Проведення рестрикції

Рестрикція плазмід рGEM-3Z i pGL3-Basic, проводилась двома рестриктазами - HindIII, XbaI. Як видно на електрофореграмі, плазміда pGL3-Basic була розрізана на два фрагменти (рис. 3.3). Вирізаний нами фрагмент відповідає потрібному розміру – 1742.

1 2

Рис. 3.4. Плазміда рGEM-3Z i pGL3-Basic після рестрикції HindIII XbaI:

1- продукти рестрикції плазміди pGL3-Basic;

2 - продукт рестрикції плазміди рGEM-3Z;

М - маркер.

Фрагменти, що нас цікавлять: ген люциферази (1742 bp) та вектор рGEM-3Z (2719 bp) були вирізані із гелю за методом, що описаний в розділі 2, а також було проведено лігування і трансформацію клітин.

3.6. ПЛР – скрініг

Для швидкої ідентифікації потрібних колоній, ми провели ПЛР – скринінг, щоб перевірити наявність нашої вставки. Попередньо ми провели лігування фрагментів люциферази та вектора рGEM-3Z і трансформували клітини. На рис. 3.5 видно, що позитивний сигнал довжиною 1742 bp спостерігається, що свідчить про успішну трансформацію та наявність вставки в трансформованих клітинах.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 М

1000

Рис. 3.5. Результати ПЛР – скринінгу колоній:

1 – негативний контроль;

2 – позитивний контроль;

3 - 12 – продукти ПЛР-скринінгу;

М - маркер.

3.7. Виділення плазміди рGEM-3Z з геном люциферази

Виділення плазміди відбувалось за методом, що описаний в розділі 2 з колоній, що дали позитивний сигнал при ПЛР – скринінгу. Перевірка виділеної плазміди проводилась за допомогою електрофорезу в 1% - агарозі.

1 2 3 4 5

М

Рис. 3.6. Електрофореграма виділеної плазміди мініпрепаративним методом

1 – 5 – продукти виділення плазміди з бактеріальних клітин;

М - маркер.

З рис. 3.6 видно, що плазміда відповідає потрібній довжині, але потребує проведенню додаткової рестрикції для більш точного підтвердження.