Кінетичні криві плр в реальному часі
Кінетична крива ПЛР в координатах має сигмоподібну форму. На ній можна виділити три стадії:
- стадію ініціації (коли ПЛР-продукти ще не детектуються флуоресцентною міткою);
- експоненційну стадію (за якої спостерігається експоненціальна залежність кількості флуоресценції від циклу ПЛР);
- плато (стадія насичення).
Рис. 1.4. Стадії кінетичної кривої.
Недоліком ПЛР в реальному часі із використанням інтеркалюючих флюоресцентних барвників є те, що вони зв’язуються із будь-якою дволанцюговою молекулою ДНК в зразку, в тому числі і з неспецифічними продуктами ампліфікації. Для того, щоб переконатися в тому, що в зразку відсутні неспецифічні продукти, після ПЛР використовують поступове плавлення продуктів ампліфікації. В процесі плавлення, коли зменшується кількість дволанцюгової ДНК, а отже і приєднаного до неї інтеркалюючого барвника, флюоресценція поступово згасає. Повне згасання флюоресценції інтерпретується алгоритмом програми у вигляді піку на координатах залежності відносної флюоресценції від температури. Кожен конкретний ПЛР продукт плавиться при певній температурі, що залежить від довжини ПЛР продукту та ГЦ вмісту. У більшості випадків наявність одного піку свідчить про специфічну ампліфікацію, тоді як додаткові піки вказують на наявність неспецифічних продуктів ампліфікації. (Рис.1.4.)
Рис.1.5.Криві плавлення ПЛР в реальному часі.
Часто ПЛР у реальному часі комбінують з ЗТ-ПЛР (зворотна транскрипція) для вимірювання малих кількостей мРНК, цей підхід дозволяє судити про рівень експресії гена, що цікавить [4,5].
Приготування проб для плр в реальному часі
Підготовка зразків до ЗТ-ПЛР в реальному часі це багатостадійний процес. Спочатку виділяється РНК, потім із препаратів РНК ензиматичним шляхом видаляються залишки ДНК, а потім процес зворотної транскрипції.
Втрати є на кожному етапі: клітинному лізисі, виділенні РНК, видаленні ДНК, зворотній транскрипції, очищенні і т.д. Використання екзогенного і ендогенного контролю, дозволяє знизити вплив таких втрат на кінцевий результат, нормалізувати результи відносно обраного контролю[6,7,8]. Підбір ефективного екзогенного чи ендогенного контролю необхідний для представлення достовірних результатів реакції ПЛР в реальному часі. Через втрати проби при її підготовці, знижується точність результатів проведеної реакції.
Ендогенний контроль
Існують гени, що експресуються індуковано (експресуються клітиною за потреби) і гени «домашнього господарства» (експресуються постійно).
Експресія останніх може змінюватися під впливом різних чинників або ж бути відносно стабільною, тобто не залежити від зовнішнього середовища та синтезувати однакову кількість продукту. Хорошим прикладом може бути 18S РНК. Цей ген є постійно транскрибованим і входить до групи генів домашнього господарства клітини, тому його часто використовується як референтний ген для нормалізації ПЛР у реальному часі . Цей ген можна вважати референтним, але для більшої точності доцільно застосовувати його в комбінаціях з іншими референтними генами [9].
Контроль є надзвичайно важливою складовою кількісного аналізу, так як дає змогу точно визначити кількість мРНК в пробі. Тому до вибору гена, що буде відповідати за таку важливу функцію, як нормалізація даних, потрібно підходити з особливою увагою і експертною оцінкою. Основні вимоги до ендогенного контролю [10,11,12,13]:
- стабільно експресуються в досліджуваній тканині незалежно від
умов експерименту;
- рівень експресії близький до такого у гену інтересу;
- праймери мають таку ж ефективність як і праймери гену інтересу.
Зазвичай, як ендогенний контроль використовують і такі гени [10,12,14,15]:
гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа;
альфа- и β-тубулін;
β-актин;
18S;
28S
Головним недоліком, що робить ендогенний контроль не універсальним – нестабільність експресії.
Існує доволі багато генів, які використовуються для нормалізації даних ПЛР при дослідженні експресії генів в плаценті - ACTB, GAPDH, 18S rRNA, TBP, SDHA і YWHAZ. Ці гени відрізняюсься за рівнем та стабільністью експресії в плаценті. Найбільш стабільними важжають гении GAPDH і 18S рРНК. Середню стабільність експресії має ген YWHAZ, а слідом SDHA, ACTB і TBP [16,17].
Рис.1.6.Порівняння стабільності генів домашнього господарства (за Murth et al, 2008).
П'ять із шести генів домашнього господарства показали високу стабільність за винятком гена TBP [18].