- •Розділ 1.
- •Загальні відомості про плр в реальному часі
- •Кінетичні криві плр в реальному часі
- •Приготування проб для плр в реальному часі
- •Ендогенний контроль
- •1.3. Екзогенний контроль
- •1.3.1. Ген люциферази
- •1.4. Фолат-залежні процеси у плаценті людини.
- •1.5. Експланти як експериментальна модель для дослідження плаценти людини
- •Розділ 2 матеріали та методи дослідження
- •2.1. Об’єкт дослідження, матеріали та обладнання
- •2.2. Методи дослідження
- •2.2.1. Літературний пошук потенціальних референтних генів для плаценти.
- •2.2.2. Підбір праймерів.
- •2.2.3. Рестрикція плазмід pGem–3z I pGel-3-Basic.
- •2.2.5. Виділення плазміди
- •2.2.7. Виділення плазміди midi-препаративним методом.
- •2.2.8. Підготовка до проведення in vitro транскрипції
- •2.2.9. Іn vitro транскрипція
- •2.2.10. Культивування експлантів
- •2.2.11. Виділення рнк
- •2.2.12. Електрофорез рнк
- •2.2.13. Синтез кДнк
- •2.2.14. Реакція плр у реальному часі
- •Розділ 3 результати досліджень
- •3.1. Загальна характеристика плазмід, що використовувалися в клонуванні.
- •3.2. Літературний пошук референтних генів для плаценти.
- •3.3. Підбір праймерів для екзогенного контролю
- •3.4. Підбір праймерів для ендогенного контролю
- •3.5. Проведення рестрикції
- •3.8. Рестрикція фрагментів отриманих після виділення днк
- •3.9. Проведення in vitro транскрипції
2.2.12. Електрофорез рнк
Для приготування 1,6% агарозного гелю взяли: 1,6 г RNasefree агарози (HELICON, Росія), 82 мл DEPC-H2O, 2 мл 50x FGRB (5x formaldehyde gel-running buffer), 16 мл 38% формальдегіду. Агарозу плавили, заливвали гель. Електрофорез РНК проводять у денатуруючих умовах. Для проби: 1 мкг РНК, до 5 мкл DEPC-H2O, 5 мкл 2xRNA Loading Dye Solution (95% формамід, 0,025% SDS, 0,025% бромфеноловий синій, 0,025% ксиленціанолF, 0,025% етидіум бромід, 0,5mM EDTA). Інкубували при 65 °С 10 хв. Проби вносили в гель. Проводили електрофорез в 1хFGRB (0,1 М MOPS (pH 7,0), 40 mM NaOAc (ацетат Na), 5 mM EDTA (pH 8,0)).
РНК візуалізували за допомогою ультрафіолетового трансілюмінатора, гель фотографували. Для інгібування РНКаз усі водні розчини були приготовані на воді, яку було оброблено DEPC.
2.2.13. Синтез кДнк
Суміш із 0,2 мкг праймерів Random Primers, 1x буфер для зворотної транскрипції, 50 од. інгібітору РНКаз RiboLock, 1мМ суміші dNTP та 200од. зворотної транскриптази довели до об’єму 30 мкл DEC-водою і додали 5 мкг досліджуваної РНК. Отриману суміш інкубували 10 хв при 25˚C. Реакцію зворотної транскрипції проводили 60 хв при 42˚C (оптимум роботи ферменту). Реакцію зупиняли інкубацією при 70˚C протягом 10 хвилин. Одержаний розчин кДНК зберігали при -20˚C.
2.2.14. Реакція плр у реальному часі
Полімеразна ланцюга реакція має декілька стадій. Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94-96 C (або до 98 C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5-2 хв., щоб ланцюги ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, так як руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК. Іноді перед першим циклом (до додавання полімерази) проводять попереднє прогрівання реакційної суміші протягом 2-5 хв. для повної денатурації матриці і праймерів. Такий прийом називається гарячим стартом, він дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.
Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з одноланцюговою матрицею. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибирається на 4-5 ºС нижче їхні температури плавлення. Час стадії - 0,5-2 хв. Неправильний вибір температури відпалу приводить або до поганого зв'язування праймерів з матрицею (при завищеною температурі), або до зв'язування в невірному місці і появі неспецифічних продуктів (при заниженій температурі).
ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюг, використовуючи праймер як затравки. Це - стадія елонгації. Полімераза починає синтез другого ланцюга від 3'-кінця праймера, який зв'язався з матрицею, і рухається вздовж матриці в напрямку від 3 'до 5'. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані полімерази Taq і Pfu найбільш активні при 72 C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини фрагмента, що ампліфікується. Звичайний час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар основ. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюжкові фрагменти. Ця стадія триває 7-10 хв. (рис.2.1).