ВСТУП
Сучасна молекулярна біологія все більше опановує точні кількісні методи визначення речовин. Вже дано ввійшли в повсякденну практику реакція зворотної транскрипції – ланцюгової полімеризації (ЗТ-ПЛР), аналіз транскриптому методами нового покоління - секвенуванням РНК та інші. За умов глобалізації всесвітньої науки все більше вимог ставиться до стандартизації методів визначення речовин.
В нашій лабораторії, дослідження фокусуються на вивченні експресії генів у плаценті людини. Оскільки плацента – це орган, що забезпечує постійний метаболічний зв'язок між організмом матері та плодом у внутрішньоутробний період, то її нормальне функціонування є необхідною умовою правильного розвитку та росту плода, а також здоров`я дитини у постнатальний період і до певної міри здоров’я матері в період вагітності і після нього. Порушення функціонування плаценти призводить до патологій вагітності, затримки росту та дефектів розвитку плоду, ускладнень з боку материнського організму. В роботі ми використовуємо метод зворотної транскрипції - полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) в реальному часі. Цей метод характеризується високою точністю визначення вмісту індивідуальної РНК, який співіснує з невизначеністю втрат на попередніх етапах підготовки зразка. Адже передують - виділення РНК із зразка, зазвичай ДНК-азна обробка, реакція зворотної транскипції. Всі ці процедури є препаративними, супроводжуються певними втратами, варіабельністю через незначні і неконтрольовані коливання умов проведення цих реакцій. Крім того, зміна реактивів, особливо ензимів, теж може вносити певний вклад у «нестандартизованість» процесів. Часто для вирішення даної проблеми використовують ендогенний контроль, тобто, поряд з геном інтересу визначають експресію гена, рівень мРНК якого має бути постійним при досліджуваних умовах, та в подальшому аналізі нормалізують експресію досліджуваного гена за рівнем експресії ендогенного контролю. Проте підібрати референтний ген (той що експресується на постійному рівні) для дослідження експресії є важким завданням, оскільки під час розвитку плаценти змінюється експресія тисяч генів. Як альтернатива ендогенному контролю використовують екзогенний контроль, який являє собою екзогенну РНК, що вноситься в кожен зразок у однаковій концентрації на етапі виділення тотальної РНК з тканини або на етапі зворотної транскрипції і який зазнає всіх ензиматичних перетворень що й досліджувана РНК. При аналізі експресії досліджуваного гена рівень його експресії нормалізують відповідно до рівня екзогенного контролю.
Метою даної роботи було створити екзогенний контроль на основі фрагменту гена люциферази світлячків (ЛС) для нормалізації генної експресії в експериментах на плаценті людини та підібрати оптимальний референтний ген та порівняти точність нормалізації за ендогенним та екзогенним контролем. Згідно мети були поставлені наступні завдання:
Переклонувати фрагмент гена ЛС із плазміди pGL-Basic у pGEM-3z;
Провести реакцію in vitro транскрипції фрагменту гена ЛС та очистити транскрипт;
Підібрати праймери до фрагмента гена ЛС та визначити оптимальні умови ампліфікації для них;
Переклонувати фрагмент гена ЛС із плазміни pGL-Basic у pGEM-3Z.
Перевірити лінійну залежність рівня кДНК за результатами ПЛР реакції від кількості внесеної екзогенної РНК на початку обробки зразків;
Виділити тотальну РНК із зразків плаценти та експланів після культивування;
Провести реакції ДНКази І та зворотної транскрипції із виділеною тотальною РНК;
Пошук потенціальних референтних генів по літературним джерелам;
Підбір праймерів до обраних референтних генів;
ПЛР з референтними генами та екзогенним контролем;
Статистична обробка даних.
Розділ 1.
Загальні відомості про плр в реальному часі
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - експериментальний метод в молекулярній біології, що дозволяє значно збільшити малі концентрації бажаних фрагментів ДНК в біологічному матеріалі (пробі). ПЛР реакція є якісним методом, тобто дозволяє виявити потрібну ДНК [1].
За допомогою стандартної ПЛР можна також напівкількісно визначити вміст індивідуальних ДНК в зразку шляхом оцінки інтенсивності смуг ПЛР продукту на елекрофореграмі та порівняти їх з контролем де відома початкова кількість ДНК перед початком ПЛР. Проте даний метод дає лише приблизні результати і має велику похибку.
Полімеразна ланцюгова реакція має декілька стадій. Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94-96ºС (або до 98ºС, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5-2 хв., щоб ланцюги ДНК розійшлися. Ця станія називається денатурацією, так як руйнуються водневі звˋязки між двома ланцюгами ДНК. Іноді перед першим циклом (до додавання полімерази) проводять попереднє нагрівання реакційної суміші протягом 2-5 хв. Для повної денатурації матриці і праймерів. Такий прийом називається гарячим стартом, він дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.
Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли звˋязатися з одноланцюговою матрицею. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай обирається на 4-5ºС нижче їхньої температури плавлення. Час стадії – 0,5-2 хв. Неправильний вибір температури відпалу приводить або до поганого звˋязування праймерів з матрицею (при підвищеній температурі), або до звˋязування в невірному місці і появі неспецифічних продуктів (при заниженій температурі).
ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюг, використовуючи праймер як затравку. Це –стадія елонгації. Полімераза починає синтез другого ланцюга від 3ˋ-кінця праймера, який звˋязався з матрицею, і рухається вздовж матриці в напрямку від 3ˋ до 5ˋ. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані полімерази Taq i Pfu які найбільш активні при 72ºС. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини фрагмента, що ампліфікується. Звичайний час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар основ. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюжкові фрагменти. Ця стадія триває 7-10 хв. (рис.1.1.)
Рис. 1.1. Стадії ПЛР – реакції:
1 - денатурація при 94-96º C;
2 - відпал при 68 ºC;
3 - елонгація при 72 ºC (P = полімераза);
4 - закінчено перший цикл.
ПЛР в реальному часі – метод, що заснований на методі полімеразної ланцюгової реакції, використовується для одночасної ампліфікації і вимірювання кількості даної молекули ДНК. На відміну від звичайної ПЛР, ПЛР в реальному часі дає змогу кількісно визначити вміст індивідуальних молекул ДНК в зразку з високою точністю. Основною особливістю ПЛР в реальному часі полягає в одночасній ампліфікації та детекції приросту ПЛР продукту, що дає змогу отримати кінетичну криву ампліфікації для кожного зразка на основі якої і вираховується початкова кількість досліджуваної ДНК (Рис. 1.1.).
Рис. 1.2. Порівняння етапів ПЛР і ПЛР в реальному часі
Для детекції ПЛР-продукту використовують флуоресцентні барвники, що забезпечують флуоресценцію, прямо пропорційну кількості ПЛР-продукту - репортерну флуоресценцію.
Загалом, детекція продуктів реакції може відбуватись двома методами:
- неспецифічно, за допомогою флуоресцентних барвників (напр. SYBR Green, SYBR Gold);
- з використанням олігонуклеотидів с флуорисцентними мітками (TaqMan ПЛР), що збільшує специфічність реакції 2.
SYBR Green забезпечує простий і економний варіант для детекції та кількісного визначення ПЛР-продуктів в ході ПЛР в режимі реального часу без необхідності використання специфічних флуоресцентних зондів або праймерів.
У ході ампліфікації барвник SYBR Green вбудовується в малу борозенку ДНК ПЛР продуктів і дає більш сильний порівняно з незв'язаним барвником флуоресцентний сигнал при опроміненні синім лазером (рис. 1.2.).
Рис. 1.3. Флуоресценція SYBR Green при приєднанні до дволанцюгової ДНК.
TaqMan ПЛР базується на використанні 5'-екзонуклеазної активності полімерази. До реакційної суміші додають ДНК-зонди, які мічені на 5'-кінці флуоресцентним барвником, а на 3'-кінці — фосфатною групою і гасником флуоресценції. Зонди комплементарні ділянці фрагменту, що ампліфікується. Гасник поглинає випроміннювання флуоресцентної мітки, а фосфатна група в 3'-положенні блокує полімеразу.
При відпалюванні праймерів зонд кількісно зв'язується з комплементарною ділянкою ДНК. Під час стадії елонгації полімераза синтезує комплементарний ланцюг ДНК і, дійшовши до ділянки, гібридизованої із зондом, починає розщеплювати пробу за рахунок 5'-екзонуклеазной активності. В результаті флуоресцентна мітка від'єднується від гасника, і її світіння може бути детектовано. Таким чином, збільшення флуоресценції буде прямо пропорційно кількості напрацьованого ПЛР-продукту.
Оскільки кінетика накопичення продуктів ампліфікації пов`язана з вихідною кількістю матриці, то це дає можливість точно оцінити її кількість [3].